NHE1、netrin-1在动脉粥样硬化中的作用

杨卉，莫显刚，王兰，张诗悦

(1.贵州医科大学，贵阳550004； 2.贵州医科大学附属医院综合病房，贵阳 550004)

冠心病、脑卒中以及周围血管性疾病是当今世界发病率、病死率最高的一组疾病。目前我国心血管病患病率及病死率处于逐年上升阶段，据2017年《国家心血管病报告》及相关研究统计显示，目前我国心血管病患者约为2.9亿，其中脑卒中1 300万，冠心病1 100万，心血管病死亡占居民总死亡原因的40%以上，居首位[1]。心血管疾病的主要病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)。As是血管难以消退的慢性炎症性疾病，以单核细胞/巨噬细胞等吞噬氧化型低密度脂蛋白胆固醇等形成泡沫细胞，并持续滞留动脉壁为主要特征[2]。预计2020年，心血管疾病造成的病死率可高达36%[3]，对人类的健康生存将造成巨大影响。研究发现，As斑块中缺氧或间歇性低氧可促进巨噬细胞滞留于斑块，缺氧可以抑制巨噬细胞迁出As斑块，影响巨噬细胞迁移抑制因子和巨噬细胞游走抑制因子表达[4]。神经轴突导向因子1(netrin-1)及受体UNC5b在巨噬细胞/泡沫细胞滞留动脉粥样斑块中起重要作用[3]。钠氢交换体1(sodium hydrogen exchangers 1，NHE1)通过调控人和哺乳动物细胞内pH的动态平衡影响细胞的形态和功能。因此，深入探讨As斑块中导致巨噬细胞滞留的新机制，对于寻求抗As治疗的新策略具有重要意义。现就NHE1与netrin-1在As中的作用予以综述。

1 As的发病机制

1.1免疫反应 As发展的新免疫学假定在1997年就已出现[5]，与晚期内膜As斑块相关的免疫浸润证明了免疫反应存在于As中[6]。然而，对主动脉中免疫细胞的存在及功能的了解却很少。Galkina等[7]采用流式细胞仪定量分析证明了在正常、非炎症的c57bl/6小鼠主动脉中存在巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞。Jongstra-Bilen等[8]证明，正常胆固醇血症C57BL/6小鼠(3～6月龄)的外膜含有T细胞和巨噬细胞的聚集，为非炎症外膜中存在的体质免疫细胞提供了进一步的证据；在As背景下，载脂蛋白E-/-与C57BL/6小鼠相比，巨噬细胞和树突状细胞的百分比增加，但T细胞的百分比没有变化，B细胞的百分比降低，这表明免疫细胞的类型与小鼠发生As的倾向之间存在联系。此外，研究显示，B淋巴细胞驻留在主动脉外膜中可能限制早期和过度的As[9]。但需要对正常人体动脉外膜进行更多的研究，以充分描述免疫细胞在As发展中的特征。

1.2感染 除了充分记载的遗传和环境因素外，微生物感染在As的发生、发展中也具有重要作用，这是由于As是一种慢性炎症性疾病，涉及各种炎症细胞和因素。细菌感染通过损伤血管内皮和激活全身及局部炎症免疫反应来促进As的发生和进展。Evani和Ramasubramanian[10]研究显示，由感染和高脂血症引起的膜生物物理变化是肺炎支原体加重As病理的关键机制之一。这些发现描述了“传染性负担”在As发展中的作用。

1.3缺氧 20世纪40年代，有学者提出了动脉斑块缺氧学说，但直到21世纪，学者们才运用新颖的缺氧标志物证实了兔As斑块中缺氧的存在[4]。Parathath等[11]研究发现，小鼠As斑块中存在缺氧，且缺氧可调节巨噬细胞的脂质代谢及基因表达。Sluimer等[12]通过给颈动脉粥样硬化患者注射细胞缺氧标志物哌莫硝唑，发现As斑块中存在缺氧；Marsch等[13]通过小鼠实验进一步证实斑块中缺氧的存在，并参与斑块不稳定的形成；缺氧参与As的主要发病机制是炎症改变，炎症导致缺氧发生，缺氧的巨噬细胞又释放炎症介质。研究发现，As患者的缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1α表达增加，而HIF-1存在于巨噬细胞及巨噬细胞衍生的泡沫细胞中，可促进炎症反应的发生、平滑肌细胞的迁移和增殖以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 表达的增加，进而促进新生血管的形成[13]。VEGF是重要的血管生成因子，普遍存在于内皮细胞、血小板等细胞表面，VEGF的阳性区域与内膜血管、斑块内出血的数量具有显著相关性[14]。HIF-1作为VEGF的调控因素可以通过HIF-1/VEGF/VEGF受体2通路促进血管生成，增加斑块的易损性[15]。Marsch等[13]发现逆转斑块缺氧可以抑制As斑块向脆弱表型的进展；此外，小鼠斑块巨噬细胞从As开始就处于低氧状态，进一步证实了缺氧与As斑块的发生、发展存在因果关系。

缺氧可导致ATP耗竭、乳酸堆积、增加蛋白降解和血管新生等，从而促进As斑块的发生、发展；缺氧诱导巨噬细胞炎症介质释放，募集淋巴细胞、平滑肌细胞或内皮细胞增殖与迁徙，吞噬脂质的细胞释放更多的促炎症因子，促进斑块炎症放大；此外，缺氧时钙蛋白酶(calpain)的活性增强，这可能因为缺氧时细胞溶质中的钙离子浓度增加，而微量钙离子激活了calpain-1[16]。calpain可使HIF-1α积聚，而这种积聚可能涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶作用以及NADPH活化后一系列钙离子信号通路的激活。在缺氧过程中，NADPH氧化酶大量激活calpain，一方面使HIF-1α积聚，另一方面大量激活的calpain作用于PEST序列，使ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)降解，从而阻止脂质流出，使细胞泡沫化[17]。而As以单核细胞/巨噬细胞等细胞吞噬氧化型低密度脂蛋白胆固醇等形成泡沫细胞，并以持续滞留动脉壁为主要特征[2]。总之，缺氧通过多途径参与As的形成与发展。

2 netrin-1、NHE1与As相关性的研究进展

2.1netrin-1与NHE1简介

2.1.1netrin-1 netrin-1是一种层粘连蛋白，在胚胎发育过程中表达，以引导神经细胞的移动。netrin-1至少存在9种可能受体，如结直肠癌缺失(deleted in colorectal cancer，DCC)蛋白受体、再生蛋白受体、UNC5a-d、唐氏综合征细胞黏附分子等。netrin-1通过与不同受体结合，产生化学吸引和排斥作用。例如，受体UNC5介导神经轴突生长排斥作用，而受体DCC介导神经轴突生导引或排斥作用，netrin-1受体UNC5在免疫细胞高表达，受体DCC低表达或无表达，故UNC5抑制免疫细胞迁徙在免疫调节及炎症中发挥重要作用[18]。

2.1.2NHE1 NHE1广泛分布于各种细胞的细胞膜，是一种具有815个氨基酸、由2个主要结构域组成的长多肽。NHE1基因分子结构中含有两个功能区域，即疏水的N端和亲水的C端，NHE的C端(由50～450个氨基酸组成)是细胞质调节区域，在NHE参与信号通路调控中发挥作用；此外，C端还决定NHE1进行Na+/H+交换的细胞内pH调定点(7.0～7.1)，当细胞内pH值低于调定点时，H+与C端功能域结合激活Na+/H+交换活性，从而决定细胞内pH水平；当细胞内pH值正常时，NHE1的活性较低，但当pH值下降到6.7时，其活性可较前增加10倍[19-21]。NHE1在心血管疾病方面的研究较多，如在心力衰竭、高血压、肺动脉高压、缺血再灌注等方面都有相关研究报道，此外，在肿瘤、炎症等方面也有不少研究[22-24]。

2.2netrin-1介导动脉斑块巨噬细胞滞留 多项研究发现了netrin-1在非神经系统方面的研究价值，netrin-1在血管、器官的生成、肿瘤的诊断和预后以及肺部炎症、急性肾损伤的表达和调节等方面均起着重要作用[25-28]。Ly等[29]研究发现，在急性金黄色葡萄球菌感染时，静脉内皮细胞netrin-1的表达下调，与UNC5b受体结合可抑制其迁移，从而发挥抗炎效应。Rosenberger等[30]在缺氧模型中再次证实，上皮细胞表达的netrin-1可抑制白细胞的聚集。van Gils等[31]研究发现，人和小鼠As斑块的巨噬细胞中均分泌netrin-1，激活netrin-1及其受体UNC5b可抑制巨噬细胞对CC趋化因子配体2的定向迁徙，抑制斑块巨噬细胞凋亡；进一步研究发现，基因剔除骨髓来源细胞的netrin-1，可促进巨噬细胞从斑块中迁移，降低斑块中巨噬细胞的水平，显著减少低密度脂蛋白受体-/-小鼠的粥样斑块。Ramkhelawon等[32]进行的免疫染色显示，在低氧环境中，netrin-1和UNC5b在人和小鼠斑块缺氧区域的巨噬细胞中表达，在体外用氧化型低密度脂蛋白或氧化应激诱导物处理的巨噬细胞中netrin-1和UNC5b信使RNA上调，且netrin-1在低氧条件下抑制巨噬细胞凋亡与HIF-1存在直接相关性；而高水平netrin-1基因的传递可以减少单核细胞的积累，以及炎症、斑块的形成；而且通过对人As病变的免疫组织化学分析，发现巨噬细胞/泡沫细胞中netrin-1的丰富表达，重组netrin-1可通过UNC5b受体阻止单核细胞迁移。在此基础上的研究进一步证实，netrin-1在As斑块巨噬细胞潴留中起重要作用[31-32]，但netrin-1抑制巨噬细胞迁徙的具体机制目前尚未完全明确。另有研究显示，内皮细胞表面表达的netrin-1会参与内皮细胞屏障作用，在As初期抑制单核细胞向动脉内膜迁移，进而抑制As形成[33]。Oksala等[34]的临床数据显示，冠状动脉疾病患者As斑块中netrin-1下调，UNC5b上调，且netrin-1的表达与炎症标志物呈负相关，尤其与M2标志物呈负相关，进一步证明在巨噬细胞中netrin-1及其化学排斥受体UNC5b的表达失调与As和不稳定的发展有关。Moore和Fisher[35]研究显示，巨噬细胞中netrin-1的缺失表达与斑块中平滑肌细胞的减少有关，并促进斑块巨噬细胞移出。综上所述，在心血管领域netrin-1可以促进血管生成，加速As，同时可保护心脏免受缺血再灌注损伤，并减少梗死面积。这些发现使神经免疫引导线索netrin-1成为一个重要的治疗靶点[36]。

2.3NHE1激活参与As斑块的发展 NHE1参与许多复杂的生理、病理过程，对维持机体正常的功能状态有重要的生物学意义[37-40]。另有相关研究表明，小鼠巨噬细胞系及大鼠心肌微血管内皮细胞在缺氧条件下NHE1信使RNA及蛋白水平增加，而且在HIF-1重组腺病毒感染人脐静脉内皮细胞中NHE1表达显著升高；同时，缺氧可升高NHE1表达、细胞内钙离子浓度及calpain活性，NHE1激活可促进胆固醇逆转运的重要分子ABCA1降解，而阿米洛利可抑制NHE1活性，从而延缓ABCA1降解[41-42]。也有研究表明，阿米洛利通过阻断NHE1活性而抑制内皮细胞凋亡，显著减轻脂多糖诱导的As斑块形成；此外，相关研究显示，普罗布考可通过抑制NHE1而抑制脂多糖，加速As，并促进体内斑块的稳定性[43]。Karki和Fliegel[44]观察缺氧/复氧后NHE1的表达情况，结果发现，NHE1蛋白表达增加使细胞更容易受到缺氧/复氧诱导的心肌细胞的损伤。这些研究表明，NHE1激活可能是As斑块发生的重要事件。

2.4NHE1参与netrin-1抑制定向迁徙的机制 神经轴突形态发生是神经发育的重要环节，轴突末端称为生长锥，生长锥对于轴突生长方向至关重要。Sin等[45]研究表明，神经细胞系PC12及小鼠新皮质神经元生长锥部位NHE1表达及活性均显著升高，NHE1抑制剂阿米洛利可减少生长锥伪足数量，抑制神经轴突形成；netrin-1可显著促进神经轴突生长；NHE1剔除小鼠神经元，netrin-1诱导早期神经轴突生长异常可被NHE1过表达所逆转。这些结果表明，NHE1是netrin-1诱导神经轴突早期形态发生及神经轴突生长所必需的。NHE1与netrin-1可协同调节细胞形态改变，而细胞形态改变是细胞迁徙所必需的，故两者可能协同调节细胞迁徙运动。研究显示，斑块中缺氧巨噬细胞可同时上调netrin-1和NHE1表达，而netrin-1可抑制巨噬细胞迁徙，推测NHE1极有可能通过某种特定机制参与或调节netrin-1的这一效应[42]。

此外，细胞迁徙过程中涉及多个事件的协同调控，如细胞极化、骨架蛋白重排以及局部黏附斑重塑等。细胞定向迁徙运动中，细胞形态改变(如细胞空间结构不对称)是必需的，细胞需形成明确的细胞前沿及拖尾(即细胞形态极化)。细胞膜G蛋白偶联受体激活，进而激活Rho家族小分子鸟苷三磷酸酶(如RhoA)及效应分子Rho激酶，进而促进黏着斑蛋白的磷酸化，调节骨架蛋白重组[46]。Rho激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，包括Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK)Ⅰ/ROCKⅡ。细胞前沿的Rho激酶等信号放大以及F-actin聚集，是细胞极化建立过程中细胞膜突触形成的驱动力，而NHE1在细胞运动的早期细胞极化中发挥整合细胞迁徙信号的重要作用[45]。研究表明，NHE1和埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin，ERM)直接相联系，并共定位在片状伪足，ROCK激活可促进NHE1向片状伪足前沿聚集[46]；而且NHE1能协同整合迁徙信号，通过RhoA/ROCK信号途径以及局部calpain活性改变等放大片状伪足的不对称信号，启动F-actin重组，加速局部黏着斑重组装[47]。另外，迁徙细胞的前沿片状伪足中Rho家族小分子鸟苷三磷酸酶与NHE1活性之间形成正反馈，促进细胞形态极化[48]。在netrin-1诱导神经轴突生长中，RhoA/Rho激酶信号通路发挥着重要作用[49-50]。神经生长中，netrin-1/DCC激活RhoA/Rho激酶通路信号，该通路激活可介导netrin-1诱导ERM磷酸化，而ERM蛋白组分中Ezrin表达缺失可抑制神经生长[51]。Rho激酶介导ERM蛋白磷酸化可直接结合NHE1的胞内区域，进而促进骨架蛋白F-actin组装及细胞骨架改建，而UNC5b主要抑制免疫细胞对多种细胞趋化因子的定向移动[19]。鉴于UNC5b介导netrin-1信号及效应很大程度上具有DCC介导的相反信号及效应的特点，而且迁移细胞前沿NHE1聚集可通过RhoA/ROCK等信号调节，在细胞极化发挥整合细胞迁徙信号的功能[20]，推测，netrin-1激活受体UNC5b，使RhoA/ROCK通路信号被抑制，从而抑制细胞膜NHE1极性分布，导致ERM蛋白磷酸化被抑制，进而抑制细胞极化及细胞迁移。

3 小 结

目前国内外关于NHE1/netrin-1相关性的研究较少，尤其是心血管疾病方面。netrin-1对早期神经突起形态发生的促进作用受到NHE1表达和活性降低的抑制，而netrin-1诱导早期神经轴突生长异常可被NHE1过表达所逆转。netrin-1可介导动脉斑块巨噬细胞滞留，同时NHE1与As斑块形成密切相关。通过不断的研究，可以揭示NHE1分子的重要功能位点在netrin-1介导巨噬细胞潴留中的作用及机制；同时，将斑块内pH值调控分子与巨噬细胞潴留直接联系起来，可以更好地丰富和发展As斑块缺氧生物学的重要理论意义。希望从干预缺氧/netrin-1/NHE1的独特视角为寻求As及相关疾病防治提供新的策略。