光学分子影像导航下精准手术的应用与研究进展

王燕，方向明

(南京医科大学附属无锡人民医院医学影像科，江苏 无锡 214023)

外科手术切除是恶性肿瘤最主要的治疗方法。虽然术前CT、磁共振成像及正电子发射计算机断层扫描等影像技术对病灶评估起重要作用，但由于时空差异性以及术中实地解剖与术前图像存在显著的差异，目前外科医师在术中探测和切除肿瘤仍主要凭借其经验，利用触诊和肉眼视觉完成病灶的识别与切除。肿瘤术后复发的主要原因之一是病灶残留，如何精准发现病灶及界定肿瘤的边界，既彻底切除肿瘤又尽可能保护正常组织结构，减少复发及术后并发症是临床手术面临的巨大难题。

随着医学影像学的发展，术中影像导航技术有了很大发展，如术中磁共振成像及CT导航技术[1-2]已用于中枢神经系统肿瘤手术，但由于设备庞大、价格昂贵及辐射剂量大等缺点限制了其在临床上的推广。光学分子影像引导下的手术具备安全无创性及操作简单等优势，为术中导航提供了新的解决方法，可能开启外科精准手术的时代。现就光学分子影像技术在术中导航的应用及研究进展进行综述。

1 光学分子影像的概念与作用

分子影像是指通过二维或三维成像设备在分子和细胞水平上对生物过程的可视化、定性或定量分析[3-5]。近年来，分子影像技术成为研究的热点，其中光学分子影像学是该领域中发展最快的方向之一。光学分子影像是利用自身的荧光物质的特性或外源性加入荧光化合物，在特定的光学成像设备下，将细胞行为转化成可视化模式，提供更多的疾病信息，辅助医师进行医疗决策。其作用可大致分为三类：①体内检测，通常采用体外光学二维或三维成像设备，检测活体内肿瘤或病变组织；②治疗，多模态探针进入活体内，通过光学成像设备实时监测肿瘤组织，担载的药物用于肿瘤治疗[6]；③术中导航，术前或术中注射荧光探针后，在光学分子影像系统的特定激发波下，荧光探针发射相应的波长，被荧光成像系统设备所接收，从而在显示屏上清晰显示出病变组织的形态，辅助医师实现精准化手术。

2 用于术中导航的光学分子成像系统与探针

光学分子影像学的发展有两个重要的方面：①对成像设备的改进，提高设备对其靶向物质的敏感性及特异性，使视野更加清晰化；②对分子成像探针的研究，开发具有更高敏感性与特异性的分子探针，提高靶向组织的显影率，达到精准化目的。

2.1用于术中导航的光学分子成像系统 目前，荧光导航系统有Fluobeam (Fluoptics,Grenoble,Franc)[7]、PINPOINT Endoscopic Fluorescence Imaging System(Novadaq Technologies Inc,Bonita Springs,FL)[8]、D-Light P system(Karl Storz)[9]以及各实验室自主研发的荧光影像设备[10]。其基本系统构成包括发射特定波长的激光器，接收荧光团发射的波长的接收器，通过图像处理显示荧光图像的显示器。

2.2用于术中导航的光学分子成像探针 光学分子成像探针根据功能的不同分为靶向型和智能型。靶向型探针又可分为主动靶向型探针和被动靶向型探针。主动靶向型探针即配体或抗体等物质与荧光分子以特定的方式结合后所构建的一种新的化合物，进入生物体内后，通过与靶点特异性结合从而显影组织区域，如抗癌胚抗原抗体与荧光染料IR800所构建的主动靶向型探针在小鼠胰腺癌模型中有很好的定位作用[11]；被动靶向型探针则是利用类似于肿瘤的高通透性和滞留效应，使探针被动积聚在组织中。智能型探针指可响应组织中特定微环境(如活性氧类[12]、酸碱度[13]、酶[14])的改变，而发生荧光信号变化的分子成像探针。

构成荧光探针的必备物质是荧光成像剂，即具有荧光特性的物质。常用荧光成像剂有吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)、荧光素钠、亚甲蓝及其他近红外荧光染料。ICG是应用最为广泛的近红外荧光染料，激发和发射波长分别为807、822 nm[15]，进入血液后，与血浆蛋白结合，主要由肝脏代谢。亚甲蓝是小分子芳香杂环化合物，激发和发射波长为670、690 nm[15]，主要经肾脏代谢。5-ALA[16]是体内生成血红素的前体物质，在特定波长(400～410 nm)的蓝光照射下，代谢产物原卟啉物质可发出红-紫荧光。荧光素钠是一种有机荧光染料，在494 nm波长的激发下，发射512 nm波长，通常由于不完整的血脑屏障而积聚于肿瘤区域[17]。

3 光学分子影像导航手术的应用与研究

3.1肿瘤瘤灶的术中实时检测、定位与分界 目前，术中外科医师主要利用触诊及肉眼观察评估病灶情况，如果肿瘤边界与周围组织分界清晰，则可进行完全切除，但色差超过人眼的分辨力或肿瘤呈浸润生长则难以对肿瘤的边界进行区分。在肿瘤切除时很大程度上依赖于经验，为了最大限度地切除肿瘤，降低残留及复发率，通常会选择切除更多的瘤周正常组织(可能导致并发症发生率的增加)或术中快速病理帮助检测切缘有无残留肿瘤组织(其耗时长增加麻醉不良反应的风险以及取材点不能覆盖所有切缘面而存在着残留及二次手术的风险)。为了寻求更精准的手术方式，光学分子影像引导下的手术逐渐进入临床与临床前研究。

3.1.1临床应用研究 ICG已广泛用于多种肿瘤手术。腹腔镜肝癌手术中，利用ICG荧光融合影像技术可达到术中实时显影肿瘤的效果，其检测率达85%(45/53)，并且还能发现术前未能检出的隐匿微小癌灶，清晰地显影肝段的界限，实现解剖性肝切除，达到肝胆外科精准手术的目的[18]。乳腺癌手术中，超声辅助下将ICG注射到病灶内，可实现术中实时显影乳腺癌，并且清晰显示肿瘤边缘[19-20]。此外，在肺结节的临床手术中，常规剂量(5 mg/kg)下，ICG最小可检测出直径为0.2 cm的结节，而在低剂量(1 mg/kg)下仍可显影肺结节，通过提高荧光成像系统的敏感性，其结节检出灵敏度高达88.7%(68/76)，但距离胸膜深度超过1.3 cm的结节，由于荧光穿透深度限制，未能显示出荧光，产生假阴性的结果[21-23]。因此，综合利用术前与术中的成像信息，多方面评估病灶的情况至关重要。

5-ALA及荧光素钠主要应用于神经领域。患者经过5-ALA引导下的胶质瘤手术的术后中位生存时间及存活率均优于常规手术组，同时荧光组患者术后均未出现功能性的损害[24]。可见，5-ALA荧光导航下的切除手术有助于提高患者的预后，展示出荧光技术的优越性。利用荧光素钠实施胶质瘤术中导航，同样可以提高总切除率，减少复发[25]。鉴于5-ALA可以被恶性胶质瘤摄取，而荧光素钠则主要积聚在血浆中，可以利用这一点充分发挥两者荧光物质的特性，形成一种双标记探针，寻求更精准的手术方式[26]。

除上述常用的荧光探针外，还有一些自主研发的荧光探针也逐渐进入临床研究。通过叶酸标记的靶向型异硫氰酸荧光素荧光探针可精确定位卵巢癌及其转移范围，实现卵巢癌的精准手术[27]。之后，在高表达叶酸受体α的肺癌患者中，利用此类探针对界定肿瘤切缘展示出较好的效果[28]。在乳腺癌手术中使用γ谷氨酰羟甲基罗丹明绿探针可以清晰显示肿瘤组织与正常组织的边界，辅助外科医师在保乳手术术中确定肿瘤切缘[29]。

3.1.2基础研究 新型荧光探针的构建需要多种成分，各成分的安全性需要重新认证，需从有效性、安全性和伦理学等多角度进行评估，因此其作为药物进入临床需要很长的周期，这使得很多荧光术中导航的研究仍处于基础研究阶段。

整合素αvβ3可在多种肿瘤中高表达，形成有助于识别正常组织的特异标志物，是一种新型的抗癌治疗靶点。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列能识别整合素αvβ3，并与之特异性结合。将介孔二氧化硅纳米粒子修饰的ICG与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列相结合，合成的新型靶向型荧光探针ICG/介孔二氧化硅纳米粒子-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列顺利检出直径为1 mm的微小肝癌转移灶[30]。结肠癌中，癌胚抗原通常呈现高水平，利用这一点，抗癌胚抗原抗体与DyLight 650荧光剂合成的靶向型探针可显影结肠癌肝转移小鼠中的癌灶，并且发现荧光组的无瘤生存期和总生存期均长于常规手术组，同时证明了荧光引导下的手术具有更大的应用前景[31]。

目前大多数临床前研究是利用肿瘤细胞可以高表达某些物质(神经激肽-1受体[32]、前列腺干细胞抗原[33]、成纤维细胞激活蛋白[34]等)，而后合成相应的靶向型荧光探针进行实验，这为光学分子影像导航手术的临床应用打下了坚实的基础。

3.2前哨淋巴结的检出 临床上，除关注肿瘤的检出、定位及分界，前哨淋巴结的检出同样具有重要意义。前哨淋巴结通常是指肿瘤组织第一站所转移的淋巴结。理论上若前哨淋巴结无转移，则可避免进行淋巴结的清扫，缩短手术时间，降低手术风险的同时大大提高患者的生活质量。快速而又精准地检出前哨淋巴结是临床医师所追求的目标。目前，临床上检出前哨淋巴结的方法有核素示踪法、纳米碳示踪法和亚甲蓝示踪法，但存在辐射大、检出率低等不足，ICG、5-ALA及其他荧光示踪剂逐渐受到外科医师的重视。

3.2.1临床应用研究 乳腺癌患者中，应用ICG检测前哨淋巴结探测率可达99%[35]，而联合使用ICG与亚甲蓝的检出率均优于单独使用ICG或亚甲蓝[36]。充分利用不同荧光染料可提高该成像技术对前哨淋巴结的检出效能。胃癌患者中，荧光素钠对前哨淋巴结的显影率高达95%(19/20)[37]，5-ALA的灵敏度和特异度分别为91.9%、90.8%[38]。此外，头颈部[39]及盆腔[40]手术中使用荧光染料检出前哨淋巴结的应用也均有报道。这些研究成果均表明光学分子影像技术在前哨淋巴结的检出中具有很好的应用前景，可以辅助临床医师简便而快速地检出前哨淋巴结。

van den Berg等[41]报道的ICG-99Tcm的双模态探针既可以术前利用正电子发射计算机断层扫描对前哨淋巴结进行定位，又可以术中动态实时观察前哨淋巴结，加上术中注射荧光素钠，更加清晰地显影淋巴管，这种双模态探针增加了辨别前哨淋巴结的准确性，显示了未来多模态探针发展的可行性。考虑到核素的辐射性，未来多模态探针应更多地往非辐射探针方向发展，如构建适用于磁共振成像与荧光导航系统的双模态探针，术前利用磁共振成像评估肿瘤整体情况，术中使用荧光导航技术实时指导手术进程。

3.2.2基础研究 关于前哨淋巴结的研究，已在头颈部肿瘤、乳腺癌、胃癌、直肠癌及前列腺癌等展开多项试验。为了减少荧光团淬灭，获得性能更稳定的荧光探针，通过将纳米凝胶与Cy7染料进行偶联，得到尺寸仅为28 nm的荧光探针，纳米尺寸的特性使其易于通过淋巴管引流至淋巴结，达到实时显影的目的[42]。术中，检出前哨淋巴结后仍需要通过快速病理判断是否有转移灶，若术中可实时评估淋巴结的状态则可达到实时指导手术进程、缩短手术时间的目的。有研究表明，构建的巨噬细胞特异性的荧光探针可实现术中实时评估淋巴结状态[43]。

3.3神经组织的保护 在外科手术中，对神经组织的保护尤为重要，一旦损伤神经会使其失去相应的支配功能，可导致声音嘶哑、呼吸困难、肢体麻木、尿失禁等一系列并发症。术中，外科医师一般在肉眼下通过观察组织的颜色及临床经验来区分神经与血管及其他组织，但是未充盈的血管及结缔组织与神经颜色相近，容易出现判断的误差，对于细小的神经更增加了辨别的难度。目前，临床上可通过神经监测仪来确定神经组织，但是流程复杂、需多个团队的密切配合以及设备昂贵等不足，限制了神经检测仪的临床应用。而光学分子影像技术由于其独特优势，在神经显影方面也有一定的应用。

3.3.1临床应用研究 鉴于ICG固有的特性，目前神经显影方面的临床报道仅限于ICG这一种荧光染料。乳突切除术中，患者的面神经在注射ICG 1 min后即可显影，医师通过荧光精准寻找到神经，减少主观盲目寻找神经的因素，从而降低神经损伤的风险[44]。同样地，在保护胸交感神经的探究中，也有类似的临床研究，术前24 h静脉注射ICG后可在胸腔镜手术中观察到胸交感神经的显影，相比以肋骨为解剖性标志来判断胸神经节的位置，利用荧光显影能清晰方便地直接识别神经组织[45]。神经束膜中的血流量可能会影响ICG的显影效果。而束膜的血流量是不可控的，因此，如何严格掌控好ICG的剂量及荧光的拍摄时间等其他可控因素来提高显影神经的效能需要进一步的实验进行探究。

3.3.2基础研究 神经显影中主要报道的是噬菌体多肽与荧光物质构建成新型的荧光探针。该探针可清晰显影小鼠的所有神经，并且已成功用于人体体外实验[46]。在腮腺癌的动物模型中，也清楚可见面神经及其分支显影，而且术后未发生神经功能的障碍[47]。此探针可以为术中保护神经组织提供很大帮助。但目前尚未正式进入临床研究，需要更进一步的探索。目前，关于荧光显影神经方面的报道较少见，这也为以后的光学分子影像研究提供了很大的空间，促使更多的学者研究这方面的相关内容，如寻求与神经结合的荧光靶向探针等。

4 小 结

光学分子影像导航手术正在临床上展开一系列的研究，取得了一定的研究成果，但仍有很多问题需要进一步探究，如提高荧光探针的敏感性、安全性、靶向性以及改良荧光成像设备等。在保证荧光探针安全性的同时，加速基础研究向临床应用的转化，让更多的患者受益。对于目前一些医院进行的单中心、小样本的临床研究，应进一步展开一系列的随机、多中心、双盲临床试验，以验证其临床应用效能。