DNA纳米结构在药物递送中的应用

马玉旋，马 祎，江 雯，高孟秋，顾月清

(中国药科大学 工学院，江苏 南京 211198)

自 1982 年美国科学家 Seeman 首次提出 DNA 纳米技术的概念以来[1]，DNA纳米技术已取得了突飞猛进的进展。其经历了从一维平面结构、到二维立体结构再到三维空间结构的发展，且发展出了DNA折纸术[2]。到目前为止，以DNA为模板通过碱基特异性互补配对形成纳米结构的研究已有数千篇报道。并且随着研究的深入，针对DNA纳米技术的研究目标已经从结构控制逐渐向功能及应用方面发展[3]。特别是近几年来，DNA 纳米结构的自组装技术日益成熟，其高度的结构可控性、生物安全性及功能多样性使得 DNA 纳米结构成为一种理想的药物递送载体[4]。本文总结了DNA纳米结构在药物递送方面的优势及应用。

1 DNA纳米结构的优势

核酸因带负电荷而难以透过表面带相同负电荷的细胞膜。因此，通常需要转染试剂(如脂质体、Lip2000等)使细胞有效摄取核酸。但研究发现，与非结构核酸不同，DNA纳米结构很容易通过膜屏障，因此 DNA纳米结构在药物递送方面，具有以下优点。

首先，DNA纳米结构可预测且尺寸和形状可控。通过可编程DNA杂交，可以方便地将DNA纳米结构制备成预先设计的尺寸和形状，产率较高。不同的DNA纳米结构的流体力学尺寸通常在10～200 nm左右，这使得它们能够利用肿瘤区域的EPR效应。此外，具有合适的尺寸和亲水性表面的DNA纳米结构，可部分减少巨噬细胞在循环过程中的光化反应和随后的清除[5]。

其次，DNA纳米结构具有可编程性和可寻址性。除了结构可编程性外，DNA纳米结构还可以方便地修饰多个功能单元[6-11]。这些功能单元(包括靶向适体、抗癌药物分子、基因序列、蛋白质有效载荷、成像对比探针等) 可通过共价键、核酸碱基对、生物素-亲和素相互作用、插入、适配体-靶点相互作用、DNA-蛋白质相互作用和包封的方式与DNA纳米结构相结合，并显示出高的负载能力和精准的位置，这使得DNA纳米结构在药物装载和靶向上成为一种较有吸引力的材料。

此外，DNA纳米结构具有被细胞内化的能力。尽管已知核算难以穿透细胞膜，但具有特点几何结构的DNA纳米结构却可以。Mao等[12]研究发现，叶酸标记的DNA纳米管能靶向癌细胞表面的叶酸受体，随之内化进入肿瘤细胞中。2011年，Turberfield等[13]研究发现，在没有配体或转染剂的存在下，DNA四面体能顺利进入共培养的活细胞中，说明具有特定结构的DNA纳米结构能被哺乳动物细胞内化，而不受DNA表面的电荷影响。

还有，DNA纳米结构能稳定存在于正常生理条件下。Yan Meldrum等[14]研究发现DNA折纸结构在细胞裂解液长达12小时孵育下，仍能保持结构稳定，依旧以折纸结构存在。相反，常规的单链或双链同条件下孵育后完全检测不到完整的DNA链。Conway等[15]研究发现，具有特点结构的三角形棱状DNA纳米结构在血清中比单链更稳定，经凝胶分析得出，在10%胎牛血清中，单链和完整结构的DNA 半衰期分别是1小时和2小时，而经化学修饰后的DNA纳米结构半衰期大于24小时。

最后，DNA 纳米结构具有良好的生物相容性。DNA分子作为一种存在于所有生物中的天然物质，具有固有的生物相容性。一些报道的DNA纳米结构已被证明在细胞和动物水平上是安全和免疫惰性的[16]。并且，DNA纳米结构最终将在细胞和生物体内被降解和清除[17]。

2 小分子药物的递送研究

具有蒽环类结构的化疗药物如阿霉素等可以插入DNA结构，并通过缓解扭转应力与DNA紧密结合在一起。利用此特征，现已构建了多种较好的载药DNA纳米结构，并对其体外和体内治疗效果进行了研究。如Huang等[17]利用DNA二十面体纳米结构负载阿霉素，并修饰MCF-7细胞的靶向的适配体进行癌症治疗。研究发现与人乳腺癌细胞株(MCF-7)孵育后，靶向DNA二十面体与单独的药物治疗或不具有靶向功能的DNA二十面体相比，细胞内化程度提高，细胞毒性降低。Ding等[19]利用三角形和管状DNA折纸纳米结构作为阿霉素递药的载体，制备了负载阿霉素的DNA折纸结构，并将其应用于正常或阿霉素耐药的人乳腺癌细胞株(MCF-7)。研究发现，DNA折纸纳米载体增强了药物在病变细胞中的积累，不仅对正常MCF-7细胞具有显著的细胞毒性，而且对阿霉素耐药的MCF-7细胞也具有显著的细胞毒性。

放射性同位素锝-99m可以共价连接到单链DNA上，然后组装到DNA纳米结构中发挥其功能。Fan[20]等设计了多臂DNA四面体纳米结构(TDNs)作为体内造影剂，可实现近红外(NIR)荧光和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)的双模态成像。他们将NIR染料Dylight-755与其中一条核心链共轭，并自组装成TDNs结构。然后在TDNs的多臂ssDNA结构上修饰靶向配体叶酸和放射性同位素99mTc。双标记TDNs探针实现了在细胞水平和动物水平NIR和SPECT双模式成像的能力。采用NIR荧光成像技术，评价了TDNs在小鼠体内的药代动力学，与单链DNA相比，其体内生物分布和循环时间明显不同。

3 功能核酸类药物的递送研究

具有独特生物医学功能的核酸能够通过碱基互补配对的方式与DNA纳米载体结合。几种功能核酸，如CpG序列、反义序列、siRNA、miRNA等，均已被设计成DNA纳米结构[21]。如Fan等[22]设计了一种含有CpG序列的DNA四面体，用简单的退火程序就可将四条DNA链(含四面体组装的核心序列和CPG序列)组装成DNA四面体结构。与游离CpG序列相比，负载了CpG序列的四面体具有较好的稳定性，无需转染试剂即可有效地被巨噬细胞RAW264.7细胞摄取。在TLR9识别后，含CpG的四面体可使肿TNF-α、IL-6和IL-12等促炎细胞因子的表达升高，显示了纳米结构的有效免疫刺激作用。Rehberg[23]等研究了装载了CpG序列的DNA纳米管在体内对免疫细胞的影响。采用单链Tiles(SST)方法设计了8螺旋DNA纳米管，并通过CpG基序对每个管中的24个Tiles进行了扩展。与其他DNA纳米载体相似，负载了CpG的DNA纳米管在巨噬细胞中表现出TNF-α反应。将DNA纳米管注射到麻醉小鼠的骨骼肌中，用体内显微镜观察到DNA纳米管被组织驻留的巨噬细胞内化。与未载药的DNA纳米管或游离的CpG不同，装载了 CpG的DNA纳米管招募大量白细胞进入肌肉组织，并激活周围细胞中的NF-κB通路，表明DNA纳米管是靶向组织巨噬细胞的有效运载工具。 Anderson[24]等设计了装载siRNA的多功能DNA四面体结构，可用于体内靶向治疗。DNA四面体纳米粒子可以将siRNA传递到肿瘤细胞中，并下调靶基因。在小鼠肿瘤模型中，叶酸修饰的DNA四面体纳米粒子比单独的siRNA(t1/2≈6min)具有更长的血液循环时间，和稳定的基因沉默效果。

4 蛋白多肽类药物的递送研究

DNA纳米结构可通过特异性反应与蛋白质或多肽相结合，已广泛用于相关药物递送。Yan[25]等人在DNA四面体纳米结构中同时组装了抗原(链霉亲和素分子)和免疫佐剂(GpG)。与抗原和CpG分子的混合物相比，共组装的DNA四面体(抗原佐剂复合物)在体内触发了强烈、特异和持久的免疫反应，而不会对DNA支架本身产生不良反应。Chen[26]等最近报道了滚环扩增(RCA)驱动的DNA-RNA纳米胶囊，将CpG、Stat3短发夹RNA佐剂和肿瘤特异性肽作为纳米疫苗用于协同癌症免疫治疗。RCA过程将CpG和shRNA结合在一起，然后自组装成DNA-RNA纳米胶囊。经PPT-g-PEG修饰后，DNA-RNA纳米粒子通过疏水相互作用进一步负载肿瘤特异性肽作为协同纳米疫苗，DNA-RNA纳米胶囊在淋巴结(LNs)中被递送给抗原提呈细胞(APC)，引起有效和持久的抗原特异性T细胞反应，并抑制肿瘤的进展。

5 智能响应型DNA纳米递药系统

具有刺激响应特性的天然大分子在生物系统中发挥各种重要作用。这些自组装生物分子在动态条件下工作，可对微妙的生物变化做出反应，以实现其功能。在自然生物大分子系统的启发下，分子尺度上的人工系统或机器的自下而上的设计、建造和操作是纳米科学和技术中的热门话题。其中，DNA分子已被证明可在感知、激活和响应中发挥关键功能，DNA纳米技术也从结构研究扩展到功能方面的研究，智能响应型DNA纳米递药系统应运而生，且已取得了丰硕的研究成果。响应因子在响应型递药系统中起重要作用，目前智能响应型DNA纳米递药系统主要可分为pH、光、温度、特异性酶和mRNA响应这几类[27]。如Kim等[28]人将富含胞嘧啶的i-motif结构域设计在四面体的一个边上，设计了可pH响应的DNA四面体结构。在正常pH下DNA四面体装载的蛋白可以免受蛋白酶的影响，但在肿瘤区域，富胞嘧啶的边在酸性pH下通过形成i-motif结构而被破坏，装载的蛋白从四面体中暴露出来并被激活。我们课题组利用肿瘤细胞端粒酶特异性表达的特性，设计了端粒酶响应型DNA二十面体结构。我们将端粒酶的响应序列和引物序列设计到DNA二十面体结构的序列中，同时装载铂纳米药物。实验发现，该DNA二十面体结构只针对端粒酶特异性表达的肿瘤细胞释药，在正常细胞内结构稳定。很好的实现了肿瘤细胞响应性释药，避免了对正常细胞的毒性[29]。

6 展望

尽管DNA纳米结构在药物递送方面已取得广泛应用，但目前还未有相关药物上市。所以其发展趋势应该以实际应用为出发点，首先应该阐明DNA纳米结构的细胞内吞机制、细胞内命运、药物动力学(即体内循环、分布、代谢、排泄等)。及研究它们的细胞内行为与这些结构物理/化学性质(例如几何形状、表面电荷、碱基组合)之间的关系。此外，DNA纳米结构的高纯度制备和大规模生产也是影响其应用的巨大挑战，这是实际生物医学应用的必要条件。目前也有研究在解决这些问题。如Shih等开发了琼脂糖凝胶分离，用于纯化高产率的DNA折纸纳米结构。相信在研究人员的不断努力下，DNA纳米结构在药物递送方面定能取得更大的进步。