程序性坏死的信号转导机制及其在创伤性颅脑损伤中的研究进展

马强，韩瑞璋，靳华，张广辉

(陆军第七十二集团军医院神经外科，浙江 湖州 313000)

1859年Virchow[1]第一次提出坏死的概念,并将其定义为快速、偶发且无控制的细胞死亡，其特征为细胞肿胀和细胞膜破裂导致的炎症反应。1972年，细胞凋亡成为第一个被发现和研究的程序性死亡方式，此后凋亡和不受调控的坏死被认为是细胞死亡的两种主要形式[2]。然而，坏死的不可调控性受到众多科学家的质疑。Fukuda等[3]通过研究缺血缺氧受损的海马神经元细胞，发现了一种既非凋亡也非坏死并受某些信号调节的新型死亡方式。Degterev等[4]将这种受信号调节的新型死亡方式称为程序性坏死。同时，Teng等[5]发现了一种能够特异性阻断由死亡受体信号通路引起的胱天蛋白酶(caspase)非依赖性细胞死亡，并将能被Nec-1(Necrostatin-1)特异性抑制的细胞死亡方式称为程序性坏死。细胞死亡命名委员会根据细胞死亡的形态学特征将细胞死亡分为凋亡、自噬和程序性坏死[6]。近年来，有效抑制程序性坏死在创伤性颅脑损伤患者救治中的作用成为研究热点，且Nec-1在颅脑损伤治疗中的有效性已得到大量动物研究证实。现就程序性坏死的信号转导机制及其在创伤性颅脑损伤中的研究进展予以综述。

1 程序性死亡方式的区别与联系

凋亡是受基因严格控制的生理性细胞死亡过程，包括外源性和内源性两种信号转导通路，均需要caspase的参与。凋亡细胞具有特定的形态学变化，如细胞皱缩变小，与周围细胞分离，染色质聚集、核固缩、碎裂、凋亡小体的形成，但无细胞膜的破裂和细胞内容物的外溢，所以不会引起炎症反应，其在维持细胞内环境稳定中起重要作用[7]。凋亡早期发生细胞膜骨架的降解，而细胞器的降解发生在凋亡后期。凋亡的激活需要caspase，也可被caspase抑制剂(凋亡抑制蛋白、细胞因子效应调节剂等)抑制[8]。自噬的特点为自噬体的形成，其是无核糖体区域的粗面内质网脱落，形成双膜结构包裹的细胞器和细胞质大分子，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，是实现细胞代谢及更新胞内细胞器的过程[9]。自噬缺乏染色质凝集，细胞质中有大量的自噬空泡形成。细胞器的破坏发生在自噬的早期阶段，细胞膜骨架的破坏发生在自噬晚期。自噬的作用主要为降解细胞内的蛋白质和异常的细胞成分，最终也可导致细胞死亡。程序性坏死是由受体相互作用蛋白(receptor interacting protein，RIP)调节的一种非caspase依赖性死亡方式，RIP1和RIP3的磷酸化及坏死复合体的形成是程序性坏死的重要标志[10-11]。程序性坏死的机制及细胞形态的改变不同于凋亡，但具有坏死经典的形态学特征：细胞肿胀变圆，细胞器肿大，随后线粒体裂解、溶酶体及细胞膜破裂导致细胞死亡，胞内物质释放形成显著的炎症反应[12]。

有研究表明，细胞凋亡和坏死是细胞死亡的两种主要方式，而自噬既可支持细胞生存也可促进细胞死亡[13]。虽然细胞凋亡、自噬及程序性坏死均有各自独特的信号通路和形态学差异，但在某些情况下，3种程序性死亡方式之间存在相互转化。如某些情况下抑制凋亡可引起自噬，当caspase缺乏时又可引起细胞发生程序性坏死，而Nec-1可以使细胞发生凋亡。其中，自噬可通过减少内源性凋亡抑制物或通过选择性减少促凋亡蛋白来促进或抑制细胞发生凋亡。自噬与凋亡既可相互促进，又可相互拮抗，主要取决于细胞所处的具体环境，如在肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α及氧化等的刺激下，细胞可通过线粒体释放凋亡诱导因子(细胞色素C及氧自由基等)诱导细胞发生凋亡[14]。然而，凋亡细胞中受损伤的线粒体也可通过细胞的自噬途径被清除，阻止细胞发生凋亡，从而对细胞起保护作用[15]。

2 程序性坏死的信号转导机制

2.1程序性坏死的启动 有很多因素可引起细胞发生程序性坏死，如TNF-α、干扰素、TNF相关凋亡诱导配体、DNA损伤、脂多糖、外伤、强酸、强碱及过氧化氢等，还包括某些细菌、病毒感染和射线等[16]。程序性坏死的启动主要由一系列受体及其配体相连接而诱导激活，不同的细胞会根据自身所处的微环境及损伤的方式或损伤的程度选择凋亡途径或程序性坏死途径。诱发细胞发生程序性坏死的受体主要有两类：死亡受体和病原识别受体。其中，病原识别受体主要由一些固有免疫细胞表达，包括固有免疫病原模式识别受体及核苷酸结合寡聚化结构域样受体等，主要参与某些细菌或病毒入侵而发生的免疫应答反应。而常见的死亡受体包括补体59、肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)1和TNFR2及TNF相关凋亡诱导配体受体等。死亡受体与病原识别受体均包含死亡结构域蛋白，其可与相应配体结合诱导细胞发生程序性坏死[17]。关于程序性坏死的信号转导机制，目前研究最深入的为TNF-α-TNFR1途径。

2.2坏死复合体的形成 在外界信号刺激下，TNFR1 被激活，TNF-α与细胞膜上TNFR1的死亡受体结合，促使TNFR1在胞质内形成同源多聚体，并发生构象改变，TNFR1可通过胞内段的死亡结构域与TNF死亡受体相关结构域蛋白结合，RIP1通过 C端的死亡决定簇与活化的TNFR1死亡受体结构域结合形成蛋白复合体，称复合体Ⅰ，为募集下游一系列的效应蛋白和相关酶的激活提供了良好条件[18]。随后细胞将复合体Ⅰ内吞，TNF-α从复合体Ⅰ中解离，同时复合体Ⅰ离开细胞膜进入胞质，死亡受体相关死亡结构域蛋白通过招募caspase-8并与之结合形成复合体Ⅱa[19]。复合体Ⅱa形成后，细胞会根据自身所处的微环境及损伤程度等选择凋亡途径或程序性坏死途径。若caspase-8被激活，其可与死亡受体相关死亡结构域蛋白形成同源二聚体，并通过相互切割而活化，进一步激活下游的caspase-3、caspase-6及caspase-7等，此时复合体Ⅰ被裂解，促进细胞发生凋亡；若caspase-8的活性因一系列理化因素被抑制，细胞会发生程序性坏死，此时RIP1发生去泛素化，RIP3被募集并与RIP1通过各自的同型相互作用模体结合形成复合体Ⅱb，成为坏死复合体中的核心部分，并启动程序性坏死下游的信号转导通路。

其中，RIPs是一种具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的蛋白质，RIP1和RIP3可通过N端保守的激酶结构域相互磷酸化，使复合体Ⅱb形成坏死复合体，同时进一步激活RIP3并在其199号丝氨酸处发生自身磷酸化，大量活化的RIP3通过一系列信号通路的传递，加速细胞程序性坏死的发生[20]。有研究显示，在RIP3基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞中，RIP1可以正常表达，细胞会发生凋亡，但不会发生程序性坏死[21]；而在有RIP3存在的情况下，细胞发生TNF-α所诱导的程序性坏死，说明RIP1是启动细胞发生程序性坏死上游的关键激酶[22]。可见，RIP3是TNF-α诱导细胞发生程序性坏死所必需，同时也是调控程序性坏死的特异性蛋白分子。

2.3程序性坏死的执行 坏死复合体形成后，主要通过3种途径诱导细胞发生程序性坏死，这3种途径既相互独立，又相互交错，是一个复杂的网络[23]。

2.3.1活性氧类(reactive oxygen species,ROS)代谢相关途径 坏死复合体通过中断亲环素和嘌呤核苷酸移位酶之间的相互作用，上调糖原磷酸化酶、谷氨酸脱氢酶及谷氨酰胺合成酶等活性，其中糖原磷酸化酶可促进糖原分解为葡萄糖-1-磷酸，过量产生磷酸化葡萄糖，谷氨酸脱氢酶及谷氨酰胺合成酶使α-酮戊二酸大量合成，加速线粒体内的三羧酸循环过程，使呼吸链被过度激活，产生过量的ROS(超氧阴离子、羟自由基及过氧化氢等)并聚集，使细胞发生强烈的氧化应激反应。一方面，ROS可阻断呼吸链，细胞因能量代谢障碍而死亡；另一方面，ROS可引起细胞膜脂质过氧化或改变细胞器膜某些通道蛋白功能，如溶酶体受到ROS的损伤后，溶酶体膜通透性的增加可导致溶酶体酶的大量释放，诱发细胞自我消化而死亡。崔红旺等[24]利用TNF-α诱导小鼠骨样细胞发生程序性坏死，并通过荧光酶标仪检测发现有大量ROS产生，使用Nec-1后ROS水平明显降低，发生程序性坏死的细胞数量也相应减少，说明诱导小鼠骨样细胞发生程序性坏死的可能为ROS。Vanden等[25]研究发现，在TNF-α存在的条件下，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1能明显促进ROS的生成和活化，促使细胞坏死，但在使用抗氧化剂或敲除细胞中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1后，TNF-α介导的细胞坏死显著减少。但有学者认为，程序性坏死的发生与ROS并没有直接联系[26]。有学者在淋巴瘤细胞的研究中发现，即使将细胞内ROS清除也不能阻止程序性坏死的发生[26]。所以对于当前的研究结果，ROS在程序性坏死过程中的作用机制取决于不同细胞类型和实验方案。

2.3.2核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)相关途径 NF-κB是一种广泛存在的转录因子，其参与多种免疫应答。在正常情况下，细胞质中的NF-κB与其抑制剂紧密结合。RIP3的过表达会诱导NF-κB激活，NF-κB与其抑制剂分离成为游离的NF-κB，游离的NF-κB转入细胞核内诱导促炎细胞因子表达，导致大量炎症细胞浸润，促进细胞坏死。另外，大量RIP3的表达对NF-κB激活有正反馈作用，可加速细胞发生程序性坏死的过程。Kasof等[27]通过TNF-α诱导宫颈癌细胞发生程序性坏死，发现RIP3的过表达可增强核因子NF-κB基因的表达，发生程序性坏死的宫颈癌细胞明显增加。

2.3.3MLKL相关途径 RIP1与RIP3具有相似的N端激酶结构域及C端同型作用结构域，RIP1/RIP3坏死复合体形成可导致RIP3的进一步聚集与活化，并在其他蛋白的协助下招募RIP3的底物分子混合系激酶区域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)。MLKL的N端具有激酶结构域，但无激酶活性，需通过C端激酶结构域与RIP3相互结合才可被磷酸化与多聚化，并使其从细胞质转移到细胞膜及细胞器膜，同时MLKL的N端能插入细胞膜结构内并与膜上的脂类物质磷脂酰肌醇磷酸盐2和5结合，使细胞膜产生通透性孔道，破坏细胞膜的完整性，Na+或Ca2+大量内流入细胞质，细胞内的渗透压过度升高导致细胞肿胀，最后死亡[28]。研究表明，抑制细胞膜脂类物质磷脂酰肌醇磷酸盐2和5的形成会明显抑制程序性坏死，但对细胞凋亡无影响[29]。MLKL基因敲除小鼠及RIP3基因敲除小鼠均具有相似的抗程序性坏死能力，且磷酸化的MLKL信号转导可以被Nec-1阻断，但不能被MLKL的功能抑制剂(2E)-N-{4-〔[(3-甲氧基-2-吡嗪基)氨基]磺酰基〕苯基}-3-(5-硝基-2-噻吩基)-2-丙烯酰胺阻断，同时RIP1的信号表达不受MLKL抑制剂的影响，故推测MLKL的作用机制位于RIP1/RIP3下游，且细胞是通过MLKL相关途径发生程序性坏死。

3 程序性坏死的抑制

程序性坏死可被许多抑制物抑制,如RIP1抑制剂、RIP3抑制剂、MLKL抑制剂等[30]。目前认为，RIP1抑制剂Nec-1是程序性坏死的特异性抑制剂，其可抑制RIP1激酶活性，将RIP1的活性片段处于失活状态，并阻止RIP3被募集及RIP1与RIP3相互磷酸化，从而减少程序性坏死的发生，这一观点已在动物模型中得到证实[31]。杨吉平等[32]认为，Nec-1可抑制RIP1的磷酸化，明显减轻小鼠神经细胞的炎症反应。崔红旺和蒋电明[33]研究发现，Nec-1可明显减少小鼠骨细胞RIP1/RIP3蛋白的表达，并有效抑制小鼠骨细胞的程序性坏死。Degterev等[4]研究发现，Nec-1可显著降低因缺血缺氧受损的脑神经细胞死亡率，明显减少神经细胞程序性坏死的发生。

4 程序性坏死与创伤性脑损伤

目前发现，创伤性颅脑损伤可导致神经细胞死亡，包括凋亡、自噬及程序性坏死[30]。其中，程序性坏死广泛存在于受伤的神经细胞中。在控制性小鼠皮质冲击损伤实验中，同时抑制TNF-α及死亡受体能明显减少小鼠脑组织的损伤面积，且小鼠在空间记忆实验中的表现也显著改善[34]。使用程序性坏死特异性抑制剂Nec-1能明显减轻创伤后脑组织的损伤，脑组织神经细胞的死亡率明显降低，说明程序性坏死的有效性抑制有助于神经细胞的功能修复[34]。Su等[15]将Nec-1用于小鼠创伤性颅脑损伤模型发现，小鼠神经细胞的程序性坏死明显被抑制，且可显著减轻脑损伤、减少脑出血量，改善脑细胞功能，促进神经功能恢复。Bermpohl等[35]研究发现，程序性坏死的有效抑制可明显减少小鼠创伤后脑损伤的面积，且小鼠的运动功能及在Morris水迷宫中的生存能力等也有明显改善。You等[36]研究发现，使用Nec-1可使小鼠大脑皮质损伤区域的中性粒细胞明显减少，同时对活化的小胶质细胞程序性坏死具有抑制作用，故认为Nec-1具有长效的抗损伤作用。

此外，Nec-1可有效减少小鼠脑损伤后神经细胞程序性坏死的发生，但神经细胞也可能发生凋亡或自噬等其他死亡，说明不同死亡方式之间存在着复杂联系，但创伤性颅脑损伤后神经细胞的程序性坏死被有效抑制并不意味着细胞可以避免死亡[37]。因此，Nec-1联合凋亡及自噬等抑制剂在创伤性颅脑损伤后保护并促进神经细胞恢复中具有重要的临床价值。

5 小 结

程序性坏死的信号转导机制复杂，参与表达及活化的分子较多，并与凋亡及自噬等其他死亡方式有复杂联系。程序性坏死的信号通路及各种新型抑制剂的不断深入研究，在众多动物模型及临床研究中取得了较大进展，但程序性坏死是一种新的细胞死亡通路，还是其他细胞死亡方式的分支及是否存在程序性坏死的核心通道等，目前其分子机制尚不明确。神经细胞属于不可再生细胞，虽然在颅脑创伤后的大量神经细胞已无法避免死亡，但抑制程序性坏死对于减少颅脑创伤后因脑组织水肿、缺血缺氧及炎症反应等所造成的二次损伤具有重要意义，为创伤性脑损伤的临床治疗提供了新方向。