NF-κB/iNOS-NO信号转导通路的临床研究进展*

史丙科 李守林

中国医科大学深圳市儿童医院,广东省深圳市 518038

1980年Furchgott等发现血管内皮细胞可合成并产生血管内皮舒张因子(EDRF),随后Palmer等研究其化学本质为一氧化氮(NO)，在呼吸、心脑血管、神经、免疫调节等领域起到重要的生物学作用。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)目的基因启动子κB序列位点(GGGACTTCC)被内毒素、细胞因子、炎症因子、活性氧(ROS)所激活从而上调表达产生大量致病性NO，高浓度的致病性NO是一种氮自由基(RNS)，可引起DNA氧化损伤、炎症反应和细胞凋亡[1]。本文从iNOS的结构和功能出发，阐述其对核转录因子NF-κB及NO的影响，并简单综述NO与临床疾病的关系。

1 iNOS的结构及功能

一氧化氮合酶(NOS)分布于生物体内各种细胞，大致分为组成型一氧化氮合酶(cNOS)和iNOS，其中cNOS又分为神经型一氧化氮合酶(nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，目前可以用序号命名NOS，即NOSⅠ/Ⅱ/Ⅲ，分别替代nNOS，iNOS和eNOS[2]。iNOS在细胞中通常不表达，但可以由细菌脂多糖(LPS)、细胞因子和其他因子诱导，主要在巨噬细胞中发现，只要确定了合适的诱导剂，酶的表达几乎可以在任何细胞或组织中被刺激，并且一旦表达，iNOS就会持续活跃，不受细胞内Ca2+浓度的调控。iNOS的调控主要在转录水平产生重要介质NO。近年来，多种研究表明，iNOS是NF-κB介导的重要调控因子，与免疫应答、氧化损伤及炎症反应有着密切的联系[3]。

2 NF-κB与iNOS基因

30余年前，Sen和Baltimore通过研究发现核因子NF-κB可以与多种基因序列中的启动子和增强子发生特异性结合，进而启动基因转录调控进程，并在细胞免疫及炎症相关反应参与疾病的发病过程中发挥重要作用。核因子NF-κB，是细胞中重要的转录因子，NF-κB家族有NF-κB1(p50及前体p105)、NF-κB2(p55及前体p100)、相关因子A(RelA)、核因子c-Rel及相关因子B(RelA)5个成员组成。P50/p65NF-κB二聚体能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB基序(GGGACTTTCC)结合；RelA/c-Rel二聚体，能与靶基因增强子的κB基序结合。研究发现[4]，NF-κB信号激活通路主要有三种：炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α/IL-1/丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)/LPS等激活的经典通路；B细胞中，LT-β/TNF家族成员TALL-1受体(BAFF-R)、B细胞肿瘤坏死因子激活因子(BAFF)BAFF-R、CD40L/CD40、Blys/LT-βR可诱导非经典信号通路活化；适当水平ROS活化PTK使IκBα(NF-κB抑制蛋白)磷酸化降解，以及糖原合成酶激酶(GSK)-3β、磷酸化P65等组成的其他通路。

iNOS基因在转录水平表达。最近，有研究发现在结核分枝杆菌PPE家族成员PPE2蛋白有一个亮氨酸拉链DNA结合基序,可能与邻近iNOS基因启动子TATA盒的GATA-1-binding寡核苷酸近端特异性盒浓度依赖性结合，此为iNOS基因转录重要组成部分[5]。根据研究表明，人iNOS基因启动子与鼠类iNOS基因启动子序列结构类似，说明NF-κB也参与人iNOS基因的转录调控[6]。

3 NF-κB/iNOS-NO信号转导通路

NF-κB信号转导通路存在于多种生物体细胞的免疫、抗凋亡、炎症反应及增殖分化反应中，而iNOS和NO是NF-κB信号转导通路中重要的两种信号转导分子[7]。iNOS基因的启动子序列含有κB位点(GGGACTTTCC)，与NF-κB特异结合，从而启动基因的转录，产生大量NO。NO的化学性质不稳定，半衰期过短，在负氧离子存在时易失活，而存在超氧化物歧化酶(SOD)和酸性pH条件时相对稳定。NO可调节NF-κB水平:生理性NO能减轻中性粒细胞的毒性作用，抑制核因子NF-κBp65向核移位，抑制黏附分子表达，下调相关黏附分子水平，保护血管壁完整性，生理性NO本身能作为NOS的负反馈抑制剂，使NF-κB水平上升，NF-κB/iNOS-NO信号通路活化，抗凋亡。相反，在高水平致病性NO作用下，抑制IκB磷酸化及降解，可使NF-κB的抗凋亡活性被抑制；内源性生理性NO部分与氧结合形成过氧化亚硝酸阴离子 (ONOO-)，进而引起脂质过氧化，损伤内皮细胞功能，还有部分与体内半胱氨酸残基(有巯基)的蛋白/谷胱甘肽(GSH)等反应，生成硫化亚硝基蛋白/硫化亚硝基硫醇，硫化亚硝基硫醇在酸性PH条件下释放的NO随呼出气体排出体外[8]。高水平致病性NO可与线粒体呼吸链中呼吸链复合物Ⅰ/Ⅱ、DNA合成酶、DNA连接酶等的Fe-S基团结合，破坏它们的活性，产生细胞毒作用；能通过cADP-核糖通路激活NAD葡萄糖水解酶、CD38样双功能酶、ADP核糖转移酶和水解酶、多聚(ADP-核糖)合成酶等，产生细胞毒作用，使细胞凋亡。过量的致病性NO通过Cox2(环氧合酶-2)可促使中性粒细胞和淋巴细胞增殖，产生iNOS,又大量产生NO,入血后结合亚铁血红素的Fe2+，形成大量亚硝酰基铁，损伤血红蛋白对氧的运输、细胞呼吸、能量代谢等，促进炎症反应的发生[9]。

4 NO与临床的关系

4.1 NO与呼吸系统疾病 NO在呼吸系统调节气道和血管平滑肌、黏液转运以及肺发育、肺损伤中起到重要作用，适量的生理性NO对人体产生正向保护作用，但过量致病性NO具有细胞毒作用[10]。气道在炎症情况下，TNF-α可诱导气道上皮细胞iNOS基因持续表达，进而产生大量致病性NO,引起炎症反应，增加气道通透性导致渗出和水肿。致病性NO与炎症细胞产生的O2-,可生成过氧亚硝酸盐，使气道发生炎性损伤[11]。肺纤维化由肺成纤维细胞分泌的胶原纤维增生聚集导致结构重塑，肺泡巨噬细胞异常活化iNOS释放大量致病性NO，导致肺成纤维细胞大量增生并分泌胶原分子，最终引起肺纤维化。目前，抑制iNOS-NO通路，可明显改善肺纤维化。有研究发现，在肺癌患者中，高/低水平NO与患者的晚期或者较差的生存率有关，持续中等水平NO可促进肺癌细胞转移中的侵袭作用。NO依赖性的炎症细胞浸润及IgG、IgA免疫复合物可引起急性肺损伤，给予硝普钠促进生理性NO适量增加，肺水肿可明显减轻，NO还可抑制NADOH氧化酶产生O2-,减少多形核细胞对血管内皮细胞的黏附及肺部的浸润[12]。接触职业性暴露因素二氧化硅等可引起肺巨噬细胞和上皮细胞iNOS表达产生大量致病性NO，诱发肺部组织炎症反应，了解其发病机制，有助于增强对肺部职业疾病的预防和调控,因此，可通过应用抑制剂来保证NO处于正常生理水平，或许可以成为治疗肺部纤维化相关疾病的新药靶点。

4.2 NO与心血管系统疾病 NO是几种最常见心血管疾病的危险因素之一。硝酸甘油在临床上治疗心血管疾病已经有150多年的历史，直到20世纪70年代末，其作用成分被证实为NO。生理性NO可以调节血管张力，促使冠脉扩张增加侧支循环，增加对心肌的保护作用；致病性NO，可经cGMP/PKG通路上调NF-κB/TNF-α,TNF-αK可刺激产生iNOS进而产生大量NO，在冠心病、高脂血症患者血管内，促进氧化应激，可引起脂质、DNA、蛋白质的过氧反应产生细胞毒作用，进而发生炎症反应、功能失常、器官衰竭等改变[13]。高水平持续病理性NO可降低心肌细胞收缩力，引起心肌功能障碍。目前部分研究已证实NO与心血管系统存在紧密联系，通过抑制NF-κB/iNOS-NO信号转导通路，可能为临床提供新的科研方向。

4.3 NO与消化系统疾病 低水平NO可降低因应激、药物等引起的氧自由基减少到最后的胃黏膜损害，NO可通过维持胃黏膜组织氧合作用来保证HCO3-以及相关营养物质的运输并且加速有毒物质的清除。作为重要的神经递质，幽门括约肌及oddi括约肌等均受NO的调控，故对胃肠动力起到重要作用。幽门螺旋杆菌激活NF-κB/iNOS-NO信号通路导致慢性萎缩性胃炎。Rashed等[14]研究发现消化性溃疡患者与对照组相比NO含量下降，胃酸分泌的能力及胃黏膜保护作用降低。研究发现iNOS诱导产生的NO在抵抗病菌感染方面同样发挥重要的作用，NF-κB、TNF-α、IL-17A、IL-8、INF(干扰素)-γ可刺激炎症细胞表达iNOS产生致病性NO，引起结肠组织水肿、充血以及功能障碍[15]。IL-6可通过NF-κB/iNOS-NO信号通路激活肝星状细胞，进而增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内机构的重建。基于上述研究，NF-κB/iNOS-NO信号通路是引起消化系统炎症反应的作用机制之一。

4.4 NO与泌尿系统疾病 NO在肾组织损伤的作用有双重性，早期肾组织nNOS、eNOS合成NO，其扩血管，抑制血小板聚集大大保护肾组织损伤，在晚期，系膜和肾小管上皮细胞产生的NO可能加剧损伤，部分原因是这些细胞被炎症因子刺激后iNOS表达，从而加重肾损伤[16]。NO主要调节肾血流动力学及肾小球微循环，Kiyotaka Mukai等研究在麻醉小鼠NO抑制剂L-NAME可增强血管收缩并伴有肾功能不全。膀胱癌患者中NO等氧化剂含量较高，提示氧自由基在膀胱癌中发挥重要的作用。脊髓损伤可导致逼尿肌—外括约肌协同障碍，从而引起膀胱出口梗阻，研究表明，增加NO供体引起其在尿道浓度增高可减轻尿道压力,这种治疗方式可在一定程度缓解脊髓损伤带来的膀胱出口梗阻问题[17]。近些年，NO与神经源性膀胱的关系成为研究热点，但其具体作用机制尚未明了，通过建立膀胱出口梗阻动物模型，选择性抑制NF-κB/iNOS-NO信号转导通路靶点，可以提供新的治疗策略。

4.5 NO与神经系统疾病 中枢神经系统氧化应激时，神经细胞内氧化作用增强，抗氧化作用减弱，ROS及活性氮(RNS)水平明显上调，引发过氧化反应、硝基化反应，可能使细胞的蛋白质、核酸、脂质以及细胞因子被损伤，进而引起炎症、异常收缩及细胞凋亡[18]。而高水平致病性NO产生原因有：一是大量乙酰胆碱、缓激肽的刺激；二是IL-1、TNF-α、INF-γ水平明显上调；三是细胞质钙离子、脂多糖、内毒素等水平明显上调；此时脑血管内皮细胞，胶质细胞、巨噬细胞、中性粒细胞产生大量iNOS、NO、ROS、RNS。高水平NO还会导致脑源性神经营养因子分泌的下调，而脑源性神经营养因子对神经元的存活、发育和分化、突触形成以及学习和记忆至关重要。阿尔茨海默病(AD)是一种典型的中枢神经系统退行性病变，少突胶质细胞(OLS)是中枢神经系统中的髓鞘形成细胞，髓鞘损伤可能与AD的认知功能障碍有关，研究表明一氧化氮(NO)作为一种信号分子，可能通过单羧酸转运蛋白1(MCT1)影响能量传输机制进而对轴突和髓鞘产生作用[19]。帕金森病时过高水平致病性NO、ROS、RNS参与毒物1甲基4苯基1236四氢吡啶(MPTP)引起脑酪氨酸羟化酶的硝基化失活，下调多巴胺水平，过高水平致病性NO激活多聚(ADP-核糖)聚合酶，阻断DNA修复并损伤神经细胞。通过选择性实用NOS抑制剂，如L-精氨酸类似物、糖皮质激素、抗氧化剂、前列腺素E2能抑制NOS合成，保护多巴胺神经元，也可以扩张脑血管，增加脑血流量[20]。

但是临床疾病成因及发展机制相对复杂，各个信号通路相互影响，单纯抑制NF-κB/iNOS-NO信号通路效果一般，随着研究的深入，对部分疾病作用机制的认识越来越全面，因此，掌握NF-κB/iNOS-NO信号通路具体作用机制，会对未来临床实践产生深远的影响。