透明质酸制备方法的研究进展

瞿晓梅，国大亮，刘洋，赵宇，刘玉璇

(1.天津中医药大学，天津 301617；2.天津达仁堂京万红药业有限公司，天津 300112)

美国哥伦比亚大学的Karl Meyer和John W.Palmer于1934年最先从牛眼玻璃体(hyaloid)中提取分离出透明质酸，由于其基本结构为糖醛酸(uronic acid)，因此命名为透明质酸(hyaluronic acid，HA)。1937年Kendall等又从细菌体中提取得到了透明质酸。随着有关HA的研究逐渐深入，人们发现HA具有良好的保湿、润滑、促进组织创伤愈合等生理学功能，可广泛应用于医药、化妆品、美容等多个领域。作为具有较高商业价值的医药、化妆品的重要组成部分，HA的工业化制备一直是人们的研究重点。HA的制备方法有组织提取法、发酵法和化学合成法等，但目前HA的大规模生产仍以动物组织提取和微生物发酵为主，对化学合成方法的研究较少。本文对HA制备方法的发展历程及近期研究热点、常用的检测HA分子量的方法进行综述，希望对透明质酸产业的进一步发展提供帮助。

1 组织提取法

组织提取法一般来源于动物组织，提取工艺由匀浆、提取、沉淀和除杂几步组成，工艺流程简单，但研磨、酸处理和有机溶剂重复萃取等苛刻的萃取条件也导致了该方法存在技术局限性，且通过动物组织提取得到的HA往往容易含有病菌或影响免疫应答[1]。由于这些技术和安全问题以及较高的生产成本，在工业化生产中组织提取法逐渐被发酵法所取代。

李宝璋等[2]综述了20世纪90年代之前HA的制备方法进展，阐明了从动物组织提取到酶工程和基因工程的演变过程。1934年，Meyer教授首次从牛眼玻璃体中提取得到HA，并在1936年改进了纯化方法。之后，人们通过对比当时有限的提取来源发现人脐带HA含量最高，最适用作HA的原料，并从中获得了高黏度的HA。20世纪40年代有学者通过改变提取剂提高所得HA的纯度，并发现了加盐可使HA的黏度明显下降。到了20世纪50年代，关于HA提取工艺的研究显著增多，多数集中于探索使用不同沉淀剂从人脐带中提取HA。1960年，GV St-aponor通过对前人方法进行总结，得出完整的一条从脐带中得到HA的路线。20世纪60年代，提取原料不再局限于人脐带，有学者从人体滑液和猪气管中成功分离出高纯度HA，并开始使用电泳法、酶解法等分离方法。1973年，Lee Sheng-San改进工艺，选用低浓度盐较好地分离开HA与硫酸软骨素等糖胺聚糖类物质。1980年之后，经过国内外学者不断探索，已经形成了完整的从人脐带、玻璃体或鸡冠中提取HA的制备工艺，方法趋于完善。从20世纪80年代到21世纪初，最常用的组织提取原料有鸡冠、人脐带和牛、羊等动物的玻璃体，但这些原料来源有限、成本高，于是近年来一些学者致力于研究从畜牧业、渔业生产过程中产生的废弃物，如鱼眼、鸡蛋壳膜中提取HA，为HA的绿色工业化生产提供科学基础。

易喻等[3]以金枪鱼眼为原料，通过比较酶解法、醇沉法、CPC法除蛋白效率，确定了金枪鱼眼提取HA的工艺路线，并对CPC法纯化透明质酸的工艺进行优化，着重于CPC反应时盐离子浓度对HA和CPC的络合以及HA-CPC络合物解离的影响。于海慧等[4]研究了酶解法从大鲵体表黏液中提取HA的最佳工艺条件，使大鲵黏液成了HA的潜在来源之一。朱文婷等[5]对酶解法提取鸡蛋壳膜中HA的工艺进行优化，考察了壳膜预处理过程对HA提取的影响，结果表明热处理和加NaCl处理有利于HA提取和减少杂质含量；确定了从蛋壳膜中提取HA的最佳工艺条件。除鱼眼、大鲵黏液、鸡蛋壳膜之外，有学者从高原鼢鼠组织、林蛙皮等材料中提取得到了HA。

2 发酵法

发酵法是由细菌发酵产生HA，与提取法相比，该法不受来源的限制，产量高、成本低，无动物来源的致病病毒的感染，但该法设备要求高、前期投入大、分离难度高[6]且链球菌等部分细菌生产得到的HA易受细菌内毒素污染。

Kendall等于1937年便已发现链球菌可产生HA。然而，早期关于链球菌产生HA的研究并不以发酵生产HA为目的，只是为了说明链球菌的这一特性及其与HA组成的荚膜与透明质酸酶的关系等[7]。20世纪80年代初，日本资生堂首次建立了以兽疫链球菌为原株，经发酵法大量生产HA的技术，价格比提纯法降低一半左右[8]。由于资生堂最初采用分批法制造的产品仍具有成本较高、产量有限的缺点，于是发展出了高收率的连续发酵法。到了20世纪90年代，我国HA的工业制备仍以动物组织提取为主，但已有学者开始研究利用诱变选育高产菌株生产HA。2000年之后，我国关于HA制备方法的研究方向逐步由组织提取法向微生物发酵法转换。早期大量关于发酵法生产HA的研究通过优化发酵条件以提高HA产量，而近年来研究重点已从提高产量转向提升其质量和应用价值。

HA发酵液常因含有一定量的蛋白质杂质而具有分离难度较大的问题，阻碍了医药级HA的产业化生产。牛全凤等[9]确定了HA发酵液中蛋白质的最优去除条件，将蛋白质质量分数降低了约15%，经硅藻土处理后蛋白质去除率高达99%以上，达到医药级HA标准。该研究表明酶解法可以有效地去除HA发酵液中的蛋白杂质。

链球菌是一种潜在病原体，生产HA的同时会产生细菌内毒素，限制了HA的应用。出于安全考虑，利用重组细菌来生产HA成了一种正在探索的可行替代方法。革兰阳性菌和革兰阴性菌均可作为宿主，包括芽孢杆菌、乳杆菌、农杆菌、大肠杆菌[10]。Hmar等[11]通过定点、双同源重组培养菌株VRJ2AB和VRJ3ABC将链球菌HA合成酶操纵子产生的HA合成基因整合到乳球菌的染色体中，不仅解决了重组细菌质粒表达系统不稳定的问题，还产生了高分子量HA(3.5～4 MDa)，为重组菌株获得高分子量HA提供了一种优化方法。

不同分子量的HA具有不同的理化特性，高分子量的HA可用于眼科、骨科和组织工程，而低分子量HA可用于产生促进血管生成、抑制肿瘤进展或诱导促炎介质表达的物质[1]。因此分子量是评价HA功能和决定其最终应用类型的重要参数之一，如何获得目标分子量的HA亟待深入研究。影响HA分子量的因素包括营养介质的组成、发酵条件的物理和化学变量、两种前体糖核苷酸的浓度以及HA合成酶[12]。高分子量HA的生产方法主要包括诱变筛选、改善发酵培养条件、异源宿主和加入不同添加剂[13]。Pourzardosht等[14]敲除透明质酸酶基因后发现透明质酸酶基因的缺失对HA的产量和高分子量HA的生产有积极影响。而陆剑飞[15]则通过重组兽疫链球菌基因并对其进行诱变筛选、优化其发酵条件，最终获得了能生产低分子量HA的优质工程菌株及一套高效、低成本的低分子量HA的制备方法。Wu[16]采用臭氧降解天然HA的方法制备了低分子量HA。

3 HA分子量检测

HA为非均一性物质，其分子量通常是多分散的，可通过确定平均分子量或表征分子量的分布来表征HA分子量，平均值的类型取决于所使用的检测方法，不同检测方法具有不同特点，其中较常用的方法有特性黏度法、电泳法、光散射结合凝胶渗透色谱法。

黏度法使用的仪器廉价、操作流程简单、耗时短，目前国家关于HA相关产品的分子量的行业标准便采用此法测量，但该法只能测得样品的平均黏度分子量(接近重均分子量)，且测量原理的客观因素、乌氏黏度计的自身因素、控温精度等均对测量结果有影响[17]。李国凤等[18]发现不同内径的仪器测得的透明质酸钠分子量有差距，内径小的乌式黏度计测得的分子量高，内径大的测得的分子量低。

HA是由氨基己糖和己糖醛酸构成的双糖单元重复连接而成的线性多糖，不论分子量大小，其质荷比恒定。采用电泳法测量HA分子量分布时，可通过加入适量添加剂形成网状结构以实现不同大小分子的分离。常用凝胶基质作为筛选和稳定分离的介质，孔径较小的凝胶可用于低聚糖和HA片段的分离，孔径较大的凝胶可用于高分子量HA的分离。

体积排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)测定分子量分布时一般需要用不同分子量大小的标准品做标准曲线，但由于HA标准品或与HA具有相同黏弹特性的标准品较难得到，因此采用SEC测定HA分子量分布时一般使用结构相近的其他多聚糖做标准品，这影响了分析结果的准确性。Shanmuga Doss等[19]考察发现使用非HA为基础的校准和注入SEC柱的样品浓度是导致的分子量估算误差的主要因素。刘莉莉等[20]采用多角度激光光散射仪与体积排阻色谱法联用(MALLS-GPC)建立了医用透明质酸钠凝胶的绝对分子量及其分布的测定方法，该法不需标准品进行校准，并可同步测定透明质酸钠含量，为医用透明质酸钠凝胶的质量控制和应用研究提供了科学基础。

常用检测方法均是对已有的HA成品进行检测，董芹[21]基于近红外光谱分析技术建立了HA精品分子量模型和发酵液中HA含量模型，可在发酵生产过程中进行测定，对实现HA生产中的实时监测和优化HA发酵工艺有重要意义。

目前国内颁布有透明质酸钠的食品及其他工业标准和组织工程医疗产品标准、医用透明质酸钠凝胶的医药行业标准，并未制定HA及相关上下游药品的药典标准。其中食品工业用和其他工业用(医药工业用除外)透明质酸钠要求分子量为8×104～2×106，但未规定检测方法；外科植入和组织工程医疗用透明质酸钠规定采用特性黏数表征分子量，但由于产品用途不同，并未规定分子量标准，只要求不低于其自身规定的标示值；医用透明质酸钠凝胶要求特性黏数不小于1 500 cm3·g-1。不同分子量的HA具有不同的理化特性，建议对HA分子量的标准规定根据其具体使用类型进行细分，以实现HA行业质量的提升，更好地与国际接轨。因此对HA分子量测定方法的研究还有待继续深入，以建立一种方便快捷、准确的检测HA分子量的方法，这将对HA制备工艺的优化有指导意义。

4 展望

HA的制备方法主要有组织提取法和发酵法。发酵法制备HA产量较高，逐渐在HA的工业化生产中占主导地位。其目前难点在于产生的HA分子量难以掌握，且易受细菌内毒素污染，影响了HA的进一步应用。有关发酵法的研究已由提高HA产量转向生产出符合人们不同需求的特定分子量的HA。通过基因工程对菌株进行重组改造和诱变筛选以获得能生产目标分子量HA的优质工程菌株将成为未来发展方向之一。

提取法最初以牛眼玻璃体、人脐带和鸡冠等为原料，这些原料来源不稳定且成本较高，限制了HA的产量。近年来有关提取法的研究侧重于探索从畜牧业、渔业生产过程中产生的废弃物里提取HA，为HA的绿色生产拓展原料市场。我国是畜牧业、渔业大国，如鱼头、鱼眼、蛋壳膜等常因无法综合利用而作为垃圾处理。以这些废弃物为原料提取HA，不仅可以降低HA的提取成本、满足市场需求，又可避免污染环境、节约资源，并能为一些低附加值的产业提供更多选择、实现价值提升。因此提取法生产HA的产量虽低于发酵法，但若完全抛弃该制备方法将造成大量的资源浪费。相关行业应加大该方面的研究投入，实现废弃物的科学综合利用和行业转型升级；政府有关部门应与相关行业密切配合，加大政策扶持力度，着力于推进废弃物循环利用提取HA的工业化，以实现降低HA成本、环保和行业可持续发展多重目的，带来较大的社会效益和经济效益。