单个核细胞治疗骨关节炎的实验研究进展

张文博 赵东宝

（海军军医大学附属长海医院风湿免疫科，上海 200433）

骨关节炎（osteoarthritis） 是以软骨破坏为特征，由机械性、代谢、炎症和免疫等因素造成的关节疾患。一般分为骨性关节病、退行性关节炎（病）、增生性关节炎 、老年性关节炎等，是常见病、多发病，好发于负重大、活动多的关节，如膝、脊柱（颈椎和腰椎）、髋、踝、手等关节，特别是膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA），我国总体患病率为18%[1]～22.8%[2]，且随年龄增加，发病率逐步提高[3]， 60岁人群患病率约50%，70岁人群约60%，80岁以上人群则可高达80%左右，我国约有1.2亿骨关节炎患者，且该病的致残率可高达53%。传统的骨关节炎治疗，一般采用物理、药物、手术等治疗方法，可减轻患者症状，但不能阻止病程进展。近年来，临床应用较多的玻尿酸（hyaluronan）关节注射，可以减轻疼痛症状、减少关节结构损伤，但降低炎症反应作用不明确、不能修复软骨缺损，且长期治疗失去效果[4]。

单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）是指具有单个细胞核的细胞总称，包含有多种异质性细胞群，如多种干/祖细胞、免疫细胞、前体细胞等，在治疗骨关节炎时，可以发挥不同细胞的协调作用。目前骨关节炎治疗研究涉及的MNCs，有骨髓、外周血、脐血、脂肪源性的MNCs等。大量研究证明，MNCs关节腔内注射，对骨关节炎有良好的治疗效果，且具有来源丰富 、易于采集、制备便捷、经济、低免疫原性、移植耐受性好等独特优势。为给大量骨关节炎患者探寻一种便捷、经济、安全、可靠、有效的治疗方法，现对MNCs制备方法，细胞组成，治疗骨关节炎的效果、机制、安全性等实验研究进行综述。

1 单个核细胞的分离和主要成分

1.1 骨髓单个核细胞

骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs）是具有单个核的细胞混合群体。目前分离BMMNCs方法，有密度梯度离心法、流式细胞分选法和免疫磁珠法等。常用为聚蔗糖（Ficoll）密度梯度离心法，方法简单、污染机会少、操作时间短，比较适合临床应用。

BM-MNCs的细胞种类，一般认为，含有造血干/祖细胞、间充质干细胞和血液内的单个核细胞3类，包括间充质干细胞（MSCs）、造血干细胞、造血祖细胞、内皮祖细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞等[5]，但各种细胞的含量及种类，受年龄、身体状况等因素的影响。骨髓浓缩物（bone marrow aspirates concentrate，BMAC）制备方法与成分与BM-MNS相似。

1.2 外周血单个核细胞

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMNCs）的分离方法目前已经相对成熟，常用Ficoll密度梯度离心法和 Percoll非连续密度梯度分离法。Ficoll密度梯度离心法，由于操作简便、价格低廉等原因更为常用[6]。

PBMNCs是外周血中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞、免疫细胞和干/祖细胞。免疫细胞有T、B淋巴细胞，吞噬细胞，树突状细胞等；干/祖细胞占单个核细胞的 0.01%～0.10%，以造血干细胞为主，亦有部分间充质干细胞和内皮祖细胞[7]。干细胞动员后，干细胞含量大量提高。

1.3 脐血单个核细胞

脐血单个核细胞（cord blood mononuclear cells，CBMNC）是胎儿脐带血中具有单个核的细胞。CB-MNC分离方法主要有：6 % 羟乙基淀粉（HES）分离法、3 % 明胶分离法、Ficoll 分离法、氯化铁溶解红细胞法以及直接离心法等。一般认为，6%HES法封闭运行、污染机会少， 所需时间短， MNC 回收率高。目前常用HES、Ficoll 分离法[8]。

CB-MNC的细胞种类，大概可以分为血细胞、免疫细胞、干/祖细胞。血细胞有尚未发育成熟的红、白细胞，单核细胞等；免疫细胞主要是淋巴细胞；干/祖细胞，种类较多，比如造血干细胞、内皮祖细胞、淋巴母细胞、骨髓细胞等。Karlupia 等[9]研究显示，HUCB-MNC中含有一定数量的神经干细胞和小胚胎干细胞，以及内皮细胞。陈超等[10]利用流式细胞技术检测HUCB-MNCs，结果显示表 达CD16（31.90%±3.67%）、CD29（71.50%±0.56%）、 CD34（3.05%±1.06%）、CD45（91.65%±9.69%）、CD73（18.90%±4.38%） 和 CD90（43.70%±0.42%）， 以 表 达 CD45，CD29和 CD90的淋巴细胞为多 。

1.4 脂肪基质细胞

脂肪组织去除成熟脂肪细胞后，其余细胞成分被称为脂肪基质血管组分 （stromal vascular fraction， SVF ）、或脂肪基质细胞、或脂肪源性基质细胞（adipose-derived stromal cell， ADSC）。获取的方法，常用酶消化法、推注破碎法和超声波法，其中超声波法又分为接触式超声波法和非接触式超声波法。破碎成熟脂肪细胞后，通过离心，获得基质细胞。研究证明，非接触式超声波法没有消化酶残留、污染概率小、细胞活性好[11]。

Zuk等[12]2001年，从抽脂手术废弃的脂肪组织中，分离出与骨髓间充质干细胞形态相似的细胞，将其命名为脂肪源性干细胞，首次证明了脂肪组织中含有间充质干细胞。研究证明，基质血管组分含有内皮细胞、非特征性的基质细胞、血液细胞和组织型巨噬细胞，其中有核细胞包括37%白细胞、造血祖细胞、基质细胞（CD45+），35%脂肪干细胞（CD31-、CD34+、CD45-）[13]。目前一般认为，脂肪干细胞的含量受年龄的影响较小。

2 单个核细胞治疗关节滑膜炎

骨关节炎是涉及软骨、软骨下骨和滑膜炎症的复杂和多组织病理改变性疾病。Benito等[14]研究显示，滑膜炎症在骨关节炎出现较早，甚至在可见的软骨变性发生之前，滑膜就出现内膜增厚，炎性细胞浸润，血管形成，血管生成因子、核转录因子-κB（NF-κB）活化，肿瘤坏死因子α （TNFα）、白细胞介素（IL）1b、环加氧酶（COX）-1、COX-2表达；且滑膜炎症持续骨关节炎的全过程。炎症介质在早期骨性关节炎中的过度表达，可能反映了相关病理生理通路的激活增加，这些通路有助于患者的软骨退化。Mathiessen等[15]分析总结了2017年之前，骨关节炎滑膜炎的病理生理学和流行病学的研究，得出滑膜炎与骨关节炎的关节疼痛、功能差有关，是影像学骨关节炎发病和结构进展的独立驱动因素，并认为治疗滑膜炎是减少骨关节炎关节疼痛、阻止骨关节炎进展的关键措施。

Menarim等[16]利用放射加脂多糖（ lipopolysaccharide）注射马腕关节滑膜炎模型，研究了自体BM-MNCs关节内注射，对滑膜炎的治疗效果与机制。分别于单个核细胞注射后24、96h和144 h收集滑膜液，进行细胞学、细胞因子定量和流式细胞术检测；144 h时，对马实施安乐死，宏观评估关节，收集滑膜进行组织学和免疫组织化学检查。结果显示，BM-MNCs治疗后96 h，炎症关节滑膜液中的巨噬细胞计数比非治疗组高24%，炎症与免疫抑制因子IL10+细胞数高10%，且随时间延长逐步增高；治疗144 h时，在组织学上，BM-MNCs治疗的关节滑膜肿胀较轻，呈浅橙色至粉红色，与健康的关节相似，而对照组中仍然异常。Menarim等[16]认为，巨噬细胞祖细胞是BM-MNCs中负责下调炎症反应的主要细胞，IL-10是软骨细胞代谢和损伤恢复的关键细胞因子，通过巨噬细胞相关作用治疗滑膜炎，IL-10减轻软骨损伤、促进软骨修复，可使成千上万的骨关节炎患者受益。

3 单个核细胞治疗关节软骨损伤

骨关节炎是关节软骨退行性变或损伤引起的一系列临床表现的总称，以软骨退变和损伤为基础，因此，治疗关节软骨退行性变或损伤是治疗骨关节炎的主要目的和手段。软骨组织无血管，如果干/祖细胞不能穿透软骨下骨为软骨修复提供细胞，软骨损伤修复将无法进行。单个核细胞为临床治疗骨关节炎提供了一种现成的自体细胞和细胞因子的来源。

细胞向损伤软骨组织迁移，是修复软骨缺损的前提。Hopper等[17]利用膝关节炎患者自体软骨细胞与自愿者PBMNCs体外共培养的体外模型，划痕法研究了PBMNCs促进软骨细胞迁移的效果与机制，结果显示，PBMNCs间接刺激3 d后，软骨细胞总迁移率提高9.7倍， PBMNCs直接共培养3 d后，软骨细胞总迁移率提高8.2倍；研究还发现，MMP9和IGF1 是PBMNCs诱导软骨细胞迁移的主要调节因子。

促进软骨再生和减少退行性变，是治疗骨关节炎的关键。Bekkers等[18]利用成年荷兰奶山羊膝关节股骨内侧髁 5 mm圆柱形软骨缺损模型，研究了BM-MNCs、未扩增软骨细胞和纤维蛋白胶复合体，治疗局灶性关节软骨损伤，促进软骨再生和抑制软骨退行性变的效果。研究表明，BMMNCs联合未扩增软骨细胞治疗促进了缺损处软骨再生，与微骨折治疗相比，减少关节软骨的退变。Zhang等[19]利用贵州小型猪在膝关节股骨外侧滑车直径6.0 mm的全层软骨缺损模型，通过大体检查、立体显微镜观察、组织学分析和 O'Driscoll评分系统软骨组织学评分，评价了Ⅱ型胶原水凝胶和BM-MNCs治疗软骨缺损的疗效。结果显示，以Ⅱ型胶原水凝胶为支架材料的BM-MNCs治疗4周时，细胞治疗组可见软骨缺损处表面形成光滑的半透明再生组织、再生组织与周围软骨之间无间隙，但界面容易识别；治疗8周时，软骨缺损完全被透明样再生组织填充，其颜色为象牙白，类似正常软骨，界面很难被识别；对照组没有软骨再生。证明了BM-MNCs可以修复全层软骨缺损，研究者认为，包括T细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞在内的BM-MNCs可能分泌大量的细胞因子（或生长因子），为MSCs的增殖和成软骨分化提供更完善、持续的微环境支持。因此，自体未培养的BM-MNCs移植是一种临床有效、经济、方便、高效软骨修复的技术。

4 单个核细胞治疗骨关节炎的动物实验

Song 等[20]利用前交叉韧带横断加内侧半月板切除的方法诱导的 小尾寒羊 KOA 模型，BM-MNCs 以4.5×108个细胞（5 mL）、BMSCs 以1×107个细胞（5 mL）的剂量，一次性关节内注射。细胞移植后 8周， 细胞治疗组软骨部分修复，干细胞组较单个核细胞组有较高的软骨再生能力和较低的蛋白多糖丢失，BM-MNCs 治疗效果不如 BMSCs，但作者认为，BM-MNCs对骨关节炎模型亦具有良好的治疗作用，且允许在手术室中直接处理细胞，无需培养和立即自体给药，降低了成本，减 少了污染风险，也不需要 GMP 设施，是一种合适的潜在的BMSCs替代物。Lv等[21]比较了 SVF和BMSCs 关节内注射，治疗小尾寒羊KOA模型的效果，发现在阻止骨关节炎进展、促进软骨再生方面，BMSCs 效果优于 SVF，但 SVF 亦可有效阻断羊骨关节炎进展的软骨破坏，促进软 骨再生。

综上所述，单个核细胞关节内注射，可以减轻或消除骨关节炎的疼痛、改善关节的功能、阻止病程的进展、促进软骨的再生，且分离操作简单、无需体外扩增培养、便捷经济、安全性好，是值得临床推广的治疗骨关节炎的较为理想的方法，但是，MNCs细胞成分复杂，来源不一，各细胞成分在治疗骨关节炎中的作用、机制、协同作用，不同来源MNCs治疗骨关节炎的效果差异，年龄、身体状况等对治疗效果的影响等，应进行深入研究。