LncRNA参与BMSCs成骨相关转录因子及信号通路的研究进展

何薇，许艳华

(昆明医科大学附属口腔医院正畸科，昆明 650000)

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一种多潜能干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌腱细胞、成核细胞和肌细胞等多种细胞类型[1]。MSC可以从多种类型的间充质组织中获得，如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、肺、肝和皮肤等[2]。与长骨相比，来源于颌骨的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有更强的成骨分化能力[3-4]。随着对MSC生物学和分子遗传学等其他领域了解不断加深，发现MSC为骨科、自身免疫和缺血性疾病提供了新的治疗选择[5]。人类基因组工程的完成，证实了93%的人类基因组能够转录成RNA，但只有2%能够被翻译成蛋白质，其余98%的RNA称为非编码RNA[6]。长度超过200个核苷酸的非编码RNA被定义为长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。尽管许多lncRNA被认为可能是转录噪声或RNA加工时的副产物，但越来越多的证据表明它们中的很大一部分是功能性的，且参与调控各种类型细胞的生长和分化[7-9]。提高BMSCs成骨分化能力是抑制骨吸收、促进骨改建的关键。已有研究证实，蛋白编码基因和小的非编码RNA参与了BMSCs向成骨细胞的分化[10]。虽然功能性lncRNA参与了BMSCs的成骨分化，但大多数lncRNA的功能尚不清楚。BMSCs的表达和分化是否依赖于LncRNA目前也不清楚。现就lncRNA参与BMSCs成骨相关转录因子及信号通路的研究进展予以综述。

1 lncRNA概述

近年来，在RNA测序技术的帮助下，已经确定了数以千计的短链和长链非编码RNA，揭示了大多数基因组实际上是转录的，但只有1%～2%的转录本编码蛋白质[8]。而lncRNA与信使RNA类似，通常由RNA聚合酶Ⅱ转录并且被剪接和多腺苷酸化，但其没有或只有很低编码潜能。lncRNA主要表现为细胞类型和发育阶段特异性表达模式，在调节多种多样的细胞功能方面发挥着重要作用。基于与附近蛋白质编码基因相关的基因组位置，可以将lncRNA分为有义、反义、内含子、基因间和增强子lncRNA，同时lncRNA的功能也要复杂得多。lncRNA在不同的细胞类型中表现出特异性和多样化的亚细胞定位，这取决于它们的分子功能。与微RNA(microRNA，miRNA)不同，lncRNA的功能并不局限于与其他RNA相互作用，lncRNA也可与蛋白质和DNA相互作用，在不同的细胞间隔中表现出非常不同的分子功能[11]。首先，lncRNA通过与蛋白质的相互作用，可以作为蛋白质复合物的支架，指导靶向蛋白质复合物(如染色质修饰物)到特定的位点[12]，然后通过信号分子调控细胞进程，根据蛋白的亚细胞定位将蛋白从染色质中隔离[13]。其次，核lncRNA也可直接或间接与基因组DNA相互作用，招募表观遗传修饰到一个特定的位点，而其他的lncRNA，如 XIST(long non-coding RNA X inactive specific transcript)和H19则结合邻近的基因组位点，启动基因组印迹[14]。最终，lncRNA通过控制细胞剪接、稳定性和翻译，调节蛋白质编码转录物直接与RNA相互作用而发挥功能[15]。

2 与lncRNA相关的转录因子及信号通路

BMSCs向成骨细胞分化涉及复杂的信号通路，且多种细胞因子参与其中。通过基因芯片技术可以分析基因组的序列信息以及基因组之间的差异表达。Wang等[16]采用基因芯片技术首次揭示了lncRNA在人BMSCs成骨分化中的表达谱，在BMSCs成骨分化过程中共鉴定出1 206个与成骨表达差异的lncRNA。同时，有研究者使用微阵列的转录组谱分析BMSCs成骨分化过程中有差异表达的编码和非编码基因，并通过进一步的生物信息学分析发现，BMSCs成骨分化可能与多种信号通路相关，且lncRNA参与其中[17]。

2.1骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)与lncRNA BMSCs成骨分化受多种细胞因子和生长因子的调控，BMP-2是众所周知的BMSCs成骨分化的有效诱导因子[18-19]。而 HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是最早发现的反式作用lncRNA，在胃癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、急性白血病等多种肿瘤组织和细胞中均存在HOTAIR的异常表达[20]。Wei等[21]研究了HOTAIR在非创伤性股骨头坏死中的成骨分化和增殖作用，提取股骨头坏死患者的股骨BMSCs，分析HOTAIR在BMP-2诱导的成骨分化过程中的表达情况，结果显示，成骨细胞分化诱导因子BMP-2作用后，HOTAIR在BMSCs的表达显著降低，提示HOTAIR可能是BMSCs分化过程中的重要因素；研究还显示，HOTAIR下调导致BMP-2诱导的BMSCs中的 Ⅰ 型胶原α1链信使RNA表达增加，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性升高。这些数据证实HOTAIR是成骨分化的调节因子，也与股骨头坏死疾病相关。Li等[22]也确定了一种lncRNA，即Bmncr，Bmncr在衰老过程中可以调节BMSCs的命运，Bmncr通过维持细胞外基质蛋白纤维调节素和激活BMP-2途径来调节BMSCs的成骨，Bmncr通过细胞外基质蛋白纤维调节素介导的细胞黏附于骨表面，激活BMP-2通路，操纵BMSCs成骨稳态环境，影响细胞成骨过程。

与其他BMPs不同，BMP-1不属于转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，BMP-1可以诱导骨和软骨发育。Zhang等[23]研究发现，miR-29b-3p在骨质疏松中高表达，通过荧光素酶活性可以测定BMP-1是miR-29b-3p的靶基因；进一步实验发现，lncRNA核富集转录体1(nuclear enriched transcript 1，NEAT1)对BMP-1具有正调节作用，同时lncRNA NEAT1对miR-29b-3p具有负调节作用，NEAT1通过调节miR-29b-3p/BMP轴促进BMSCs的成骨分化。这项研究确定了BMP-1和NEAT1在骨质疏松症中的潜在作用，有助于了解骨质疏松症的发病机制，并找到治疗骨质疏松症的新靶点。经过进一步的研究，利用生物信息软件分析发现，MSX1(muscle segment homeobox-1)、BMP-1和Smurf1这3个成骨基因周围存在相关联的lncRNA，其中2个lncRNA(AF289591和uc003xbe)与成骨基因BMP-1相关[24]。

BMP-4是BMP家族的另一个成员，对BMSCs生长调节、分化和存活起关键作用[25]。BMP-4是神经系统发育过程中重要的形成蛋白，研究发现，BMP-4也参与成骨，lncRNA母系表述基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)过表达可通过靶向调控BMP-4转录促进BMSCs成骨分化，位于BMP-4基因附近的MEG3可以使转录因子SOX2(SRY related HMG box-2)与BMP-4启动子解离，从而影响细胞成骨，提示lncRNA MEG3的表达可以为治疗多发性骨髓瘤提供新的证据[26]。

2.2Runx蛋白家族与lncRNA Runx2属于Runx蛋白家族，是一种能诱导BMSCs向成骨细胞分化和成熟的关键转录因子，在骨修复与重建中发挥重要作用[27]。使用lncRNA芯片分析糖皮质激素处理的BMSCs中lncRNA TCONS_00041960的表达情况，发现TCONS_00041960的上调促进了成骨基因Runx2的表达[28]。Zhuang等[29]对来自健康供体和青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)患者的BMSCs进行微阵列分析，结果发现，一种新的lncAIS(基因符号：ENST00000453347)与AIS患者BMSCs成骨有关，AIS BMSCs中的lncAIS下调不能募集核因子蛋白90，且消除了同源异形盒D8(homeobox gene D8，HOXD8)信使RNA的稳定性，阻碍了Runx2转录，阻止了细胞成骨分化。Cui等[30]用不同浓度的葡萄球菌蛋白A对人BMSCs进行处理，模拟体外炎症微环境，使用lncRNA微阵列分析在葡萄球菌蛋白A触发的炎症微环境中BMSCs成骨分化期间lncRNA和信使RNA的完整表达谱，结果发现，用NONHSAT009968慢病毒感染来沉默BMSCs中NONHSAT009968的表达，Runx2的活性增加，表明lncRNA NONHSAT009968可能是促进成骨细胞形成的新靶点。

2.3Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路与lncRNA lncRNA可以通过调节信号通路激活BMSCs调节成骨。Wnt/β-catenin信号网络与干细胞自我更新和分化密切相关，可以控制干细胞的命运[31-32]。lncRNA肝癌高表达转录本(highly up-reglated in liver cancer，HULC)是各种人类疾病发展的重要调节因子，通过转染改变BMSCs中HULC和miR-195的表达，发现HULC过表达可下调miR-195，增强Wnt/β-catenin信号通路的表达[33]。lncRNA-p21与Wnt/β-catenin也密切相关，Xia等[34]从8周龄和18个月大的雄性C57BL/6小鼠中分离出BMSCs，发现沉默老龄小鼠BMSCs中的lncRNA-p21后，通过Wnt/β-catenin途径相互作用可以提高老龄化小鼠的BMSCs成骨能力。提示靶向调控lncRNA-p21可能对恢复老年个体中的内源性MSC具有重要的治疗意义。另一项研究抑制了肿瘤低表达lncRNA(low expression in tumor，LET)，结果促进了BMSCs增殖，LET可负调控BMSCs中TGF-β1的表达，小浓度的TGF-β1通过激活Wnt/β-catenin途径促进BMSCs的增殖[35]。因此，可通过抑制LET上调TGF-β1的表达，激活Wnt/β-catenin途径，促进BMSCs增殖[32]。含BED型锌指蛋白3(zinc finger BED-type containing 3，ZBED3)是MSC中表达最高的lncRNA之一，具有促进骨形成分化的能力。Hu等[36]成功建立了骨损伤模型，结果显示，上调的ZBED3通过激活Wnt/β-catenin信号转导途径降低白细胞介素-1β的表达，从而促进BMSCs的分化和增强骨再生。这些研究从不同层面验证了lncRNA参与了BMSCs的成骨分化，同时激活或抑制成骨相关蛋白的表达。

2.4TGF-β与lncRNA TGF-β是BMP超家族成员之一，在骨基质中高表达，与成骨细胞分化和骨发育密切相关，TGF-β对体外多种细胞的增殖和分化具有显著影响，对骨吸收具有复杂的作用，可抑制破骨细胞的形成和破骨细胞活性[37]。SIRT1(sirtuin 1)能够使β-catenin去乙酰化以促进其在细胞核中的积累，这与BMSCs分化相关的基因转录有关；此外，SIRT1在BMSCs向成骨细胞的分化中起关键作用，SIRT1激活及抑制化合物可分别增加和减少成骨细胞标志物和骨矿化的表达，提示SIRT1表达的变化与成骨细胞分化有关；而且，TGF-β配体激活TGF-β受体启动Smad3信号，Smad3信号又可以协同激活SIRT1转录[38]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是在缺氧感受与缺氧诱导方面发挥重要功能的转录因子，Xu等[39]研究人BMSCs中lncRNA HIF-1α成骨细胞分化，结果发现，TGF-β可抑制BMSCs中SIRT1的表达，低水平的SIRT1导致lncRNA HIF-1α上调，相反SIRT1的过表达导致lncRNA HIF-1α-AS1下调，通过促进乙酰化来增强同源异形盒D10(homeobox gene D10，HOXD10)的表达，而HOXD10表达在促进成骨细胞分化中起重要作用，因此TGF-β通过SIRT1和lncRNA HIF-1α-AS1导致BMSCs分化为成骨细胞。提示HIF-1α-AS1是成骨细胞分化的重要介质，并因此可以作为基因治疗剂用于人骨疾病的治疗。另外，lncRNA H19也与骨关节炎、骨质疏松息息相关，Huang等[40]发现，人BMSCs成骨分化后lncRNA H19显著上调，H19可协调miR-675抑制TGF-β1信使RNA和蛋白的表达，而TGF-β1下调后可抑制Smad3磷酸化，该研究发现了一条新途径，即H19/miR-675/TGF-β1/Smad3/组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)途径，调节BMSCs的成骨分化。lncRNA H19作为竞争性内源RNA还可以调节Wnt/β-catenin途径，这也揭示了lncRNA在协调骨生成中的作用[41]。

2.5促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号与lncRNA MAPK家族调控BMSCs的分化、矿化和增殖[42]。p38是MAPK通路的成员之一，是调节炎症、细胞分化、细胞生长、死亡等多种过程的重要调控因子[43]。目前已有研究证实，p38 MAPK信号通路的激活是BMSCs成骨分化的关键触发因子[44]。Zhang等[45]研究发现，lncRNA分化拮抗非蛋白编码RNA(discrimination antagonising non-protein coding RNA，DANCR)参与了人来源的BMSCs的成骨分化，DANCR通过p38 MAPK通路调控增殖和成骨分化；为了阐明p38 MAPK对DANCR相关细胞增殖和成骨分化的影响，将转染si-DANCR的BMSCs用特异性p38抑制剂SB203580处理，结果发现，DANCR上调导致p38 MAPK通路失活，DANCR与MAPK通路的关联可能为骨形成分化调控机制提供新的见解。

骨质疏松症是一种严重的慢性系统性骨质疏松疾病，其特征在于低骨密度(bone mineral density，BMD)和结构障碍。研究表明，BMSCs的异常分化是绝经后妇女骨质疏松症发生的最根本原因，骨质疏松症患者BMD低表达和β-Ⅰ型胶原羧基端肽(β-carboxyl terminal peptide of typeⅠcollagen，β-CTx)高表达[46]。Jiang等[47]通过实验创建小鼠骨质疏松模型，测量小鼠脊柱的BMD、血清β-CTX水平和ALP活性，结果发现，BMD降低，β-CTx和核仁小分子RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)表达增加。在成骨诱导剂刺激的BMSCs中，ALP活性和磷酸化p38蛋白水平升高，SNHG1表达下调；同时SNHG1过表达增强了神经前体细胞表达下调因子4(neural precursor cell down-regulation factor 4，NEDD4)和磷酸化p38之间的相互作用，破坏了磷酸化p38的蛋白质稳定性，并促进了磷酸化p38的泛素化，而泛素化又是一种重要的翻译后调控机制，由泛素-活化酶(E1)、泛素缀合酶(E2)和泛素-连接酶(E3)介导[48]。已经证实，E3家族成员在成骨分化中发挥重要作用[49]。在E3泛素连接酶中，Nedd4可通过介导泛素化和降解骨肉瘤细胞抑制p38活化[50]。Jiang等[47]的实验证明，lncRNA SNHG1通过Nedd4介导的泛素化负向调节p38 MAPK信号通路的调节机制，从而抑制BMSCs的成骨分化。Zheng等[51]也成功建立了SD大鼠骨质疏松模型，通过即时聚合酶链反应检测lncRNA肺腺癌转移相关转录因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)在骨质疏松大鼠和正常大鼠中的表达，培养并转染BMSCs以建立MALAT1敲低模型，结果发现，lncRNA MALAT1在骨质疏松大鼠中低表达；此外，lncRNA MALAT1通过增强MAPK信号通路的激活来抑制BMSCs的成骨分化，从而促进骨质疏松症进程。这些研究均表明lncRNA参与MAPK通路，从而影响BMSCs的成骨过程。

3 小 结

lncRNA在发育和分化过程中对基因表达的控制起着至关重要的作用。与miRNA不同，lncRNA可以折叠成复杂的二级结构和高阶结构，为蛋白质和目标识别提供更大的潜力和通用性。多种lncRNA参与了BMSCs的成骨分化，lncRNA在调节BMSCs增殖方面显示出令人鼓舞的趋势，而且这些lncRNA与各种骨疾病有着不可分割的关系。通过阐述lncRNA相关的重要的成骨相关因子和信号通路，证明了lncRNA与BMSCs的成骨相关，而且这些lncRNA也与骨相关疾病密切相关。然而，lncRNA参与BMSCs病理过程中的具体调节机制，还需要进行深入的研究。