肝纤维化治疗靶标研究进展

徐诗雨，郭惠婕，刘揭，姜文姣，郝琨

(中国药科大学药物科学研究院药物代谢动力学重点实验室，南京 210009)

大部分慢性重症肝病与纤维化相关，且肝纤维化可能进展为肝硬化，若不加以预防，可能会导致肝癌和肝功能衰竭。肝纤维化由各种因素导致的慢性肝损伤引起，如饮酒、病毒、自身免疫和胆汁淤积等，这些因素对肝脏的共同作用是产生导致切口愈合反应异常的慢性炎症。炎症可通过引发一系列炎症反应和释放多种炎症细胞因子刺激慢性肝损伤向肝纤维化转变[1]。目前认为肝星状细胞的活化是肝纤维化的核心事件，活化的肝星状细胞可进一步转化为肌成纤维细胞，该细胞与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的形成有直接关系[2]。除肝星状细胞外，许多研究者也重视ECM对肝纤维化的直接影响。肝脏中纤维化反应的产生导致ECM合成增多，而降解减少，两者失去动态平衡，使得ECM过度积累，导致纤维性瘢痕形成，该过程受相关酶的调节[3]。虽然肝纤维化在进入肝硬化之前有逆转的可能，但迄今为止临床尚缺乏特异性有效逆转或阻止肝纤维化进展的药物，因此寻找肝纤维化治疗靶点具有重要意义。现就肝纤维化治疗靶标研究进展予以综述。

1 肝纤维化的发生机制

肝纤维化即肝脏内瘢痕组织，主要由ECM过度积累引起。肝纤维化是众多慢性重症肝病发展的共同病理基础，是肝硬化的早期和必经阶段。在体内外炎症、自由基、胆汁酸、毒素、病毒等危险因素的持续重复刺激下，肝脏内库普弗细胞、单核细胞、胆管上皮细胞、血管内皮细胞等非肝脏实质细胞，分泌促纤维化细胞因子、生长因子和其他活化纤维化下游效应物等致纤维化物质进入细胞间液，进而激活肝星形细胞发生表型及功能改变，转变为肌成纤维细胞并不断增殖，肌成纤维细胞通过旁分泌及自分泌机制合成大量胶原和蛋白多糖等ECM大量蓄积在肝脏细胞间液中形成瘢痕，最终形成肝纤维化[4-7]。

慢性肝脏炎症的持续刺激是进行性肝纤维化和肝硬化发展的初级生物学标志。肝脏具有独特的解剖结构，其通过门静脉和胆管与肠道相连，故肠道菌群产物可以直接输送至肝脏[8]。这意味着在肝损伤或肠黏膜破裂的情况下，具有免疫调节活性的有毒物质(如脂多糖)可以渗透至肝脏并激活巨噬细胞。而巨噬细胞激活能促进肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1α/β、IL-6、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等多种炎症细胞因子的表达和分泌。随后，这些炎症因子激发肝非实质细胞释放致纤维化物质，致纤维化物质启动中下游肝纤维化程序，使肝星状细胞转变成肌成纤维细胞，并越来越多地表达大量ECM成分。

研究者认为，在纤维化发生过程中，肝星状细胞的活化具有重要地位[7]。肝星状细胞有两种不同的表型，正常肝脏中为静息状态，病变时则为活化状态。促进肝星状细胞活化的致纤维化物质有纤维化细胞因子、生长因子、转化生长因子和血小板衍生生长因子等。在正常肝脏中，肝星状细胞是储存维生素A的主要细胞。然而在各种因素的刺激下，静止的肝星状细胞释放维生素A，细胞本身的表型和功能均发生改变，使得肝星状细胞具有移动性、收缩性、化学趋化性，并进一步转变成病理活化状态下的肌纤维细胞，继而引起ECM种类及数量的增加[9]。目前认为，肝星状细胞活化形成肌成纤维细胞是ECM最重要的细胞来源。

肝纤维化过程的最终环节是ECM过度堆积。诱发肝纤维化的ECM由胶原蛋白、糖胺聚糖、层粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖组成[10]。其中，胶原蛋白是ECM的主要成分，其作为完整的超分子结构为纤维化瘢痕组织提供结构框架。在肝纤维发生初期，ECM形成纤维的速度远大于ECM的溶解速度，使得ECM纤维发生占据主导地位，导致过量ECM沉积纤维形成。在这一病理过程中，同时还伴随着基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的分泌减少和自身活性的下降，以及金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)的增加，从而导致ECM难以溶解[11]。其中，MMPs主要来源于静止的肝星状细胞、肌成纤维细胞及库普弗细胞等[12]。而TIMP-1是肝脏中MMPs的主要生理抑制剂，金属蛋白酶生理抑制剂的失调也可以促进肝脏纤维化反应加重，纤维蛋白合成和纤维蛋白溶解稳态的破坏导致功能缺陷的瘢痕组织不断被单向填充，最终导致肝纤维化。

2 肝纤维化逆转

从病因治疗法的角度来看，炎症、自由基、胆汁酸、毒素、病毒等刺激因素是主要病因，是可以被干预的环节。减少不利营养因素和环境因素，如高脂食物、酒精、药物滥用等有助于减轻纤维化进展[13]。对于病毒，如慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者，采用有效的抗病毒疗法可以防止肝纤维化恶化，甚至会使其发生逆转[14]。目前，常用的抗病毒药物有干扰素、利巴韦林、拉米夫定及胸腺肽等[15-17]。此外，对于胆汁淤积型肝纤维化，熊去氧胆酸治疗有一定效果[18]。然而，病因治疗法逆转的肝纤维化改善程度较浅，仅适用于初期肝纤维化患者，对于程度较重的肝纤维化现象难以实现肝纤维化逆转。

肝损伤早期，库普弗细胞、单核细胞等分泌转化生长因子-β，引起肝星状细胞激活。而转化生长因子-β主要通过细胞内的Smad通路介导肝星状细胞的生物学活性[19]。因此，可以通过免疫抑制剂霉酚酸酯和雷帕霉素阻断Smad通路来抑制肝纤维化进程[20]。此外，单核细胞和巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子-α具有促炎及细胞毒性作用，它不仅能直接刺激肝星状细胞的增殖，还能与IL-1、IL-6共同通过肝炎症反应间接刺激肝星状细胞的活化[21]。有研究者在肝癌细胞株Huh7细胞上，用肿瘤坏死因子-α抑制剂 Lenalidomide成功抑制了丙型肝炎病毒的感染及后续纤维化[22]。

抑制肝星状细胞向肌成纤维细胞活化，减少ECM是肝纤维化形成的终末环节。此过程一方面可使活化的肝星状细胞失活，从而阻止其分化为肌成纤维细胞；另一方面为细胞启动凋亡信号，即启动肌成纤维细胞凋亡程序。在肝脏的生理稳态环境下，正常的肝脏组织需降解多余的胶原、糖胺聚糖、层粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖等ECM成分。该过程涉及的主要降解物质为MMPs，它是一种锌和钙依赖性蛋白水解酶，可由多种细胞产生，主要作用为降解ECM的胶原蛋白。因此，MMPs的活化在肝纤维化消退过程中必不可少。

3 肝纤维化消退的潜在靶标

3.1靶向炎症介质 在肝纤维化中，ECM的炎症微环境提供了诸多的潜在药物靶标。其中，代表性的炎症靶标为骨桥蛋白-1，又称骨涎蛋白-1，其由约300个氨基酸组成，在肝脏中具有广泛的生物活性。它在纤维化组织中高度上调，并影响了人和小鼠肝脏中产生致纤维化物质的诸多细胞的功能[23]。根据这一病理基础，治疗实体与中和受体均适合作用于骨桥蛋白，进而调节细胞功能并减少肝纤维化的发生。

IL-12是一种异源二聚体细胞因子，其主要由树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞以及一些抗原呈递细胞产生。肿瘤坏死因子-α能促进分化的CD4+T辅助细胞增殖，诱导自然杀伤细胞和T细胞产生细胞因子(主要成分为γ干扰素)，继而发生抗炎反应和免疫反应。所以，IL-12可以通过抗炎反应，间接抑制肝纤维化的发生。同时，γ干扰素又能促进抗原呈递细胞再次分化和增殖，使IL-12大量分泌，形成一个强大的反馈环[24]。可见，IL-12在细胞炎症反应、免疫系统调节和肝脏纤维化逆转中扮演重要角色，可以通过增加肝内IL-12的表达来减缓肝纤维化的发生。在IL-12的抗肿瘤治疗中，有实验利用新型EB病毒作为载体，将IL-12靶向导入不同的肝癌细胞株内，并检测IL-12的活性[25]。该新型EB病毒携带人甲胎蛋白基因的启动子和增强子。逆转录聚合酶链反应检测结果显示，产生人甲胎蛋白基因的肝脏肿瘤细胞中有IL-12信使RNA的转录[25]。随后的活性检测证明，肝癌细胞中表达的IL-12有诱导γ干扰素产生生物学活性的功能[25]。肿瘤局部高浓度的IL-12可以促进细胞毒性T淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞和自然杀伤细胞等在肿瘤部位大量浸润并增强它们的抗肿瘤功能，增强辅助T细胞-1介导的细胞免疫反应，最大限度地减少全身应用IL-12所产生的副作用，并最大限度地发挥IL-12的抗肿瘤作用。因此，可以借鉴EB病毒pEBAF运载IL-12靶向作用肿瘤细胞的机制，通过转基因工程介导IL-12产生靶向肝纤维化组织的作用，减缓甚至逆转肝硬化和肝纤维化进程。

3.2靶向抑制肝星状细胞活化 肝纤维化中过剩的ECM被MMPs降解，MMPs主要由静止的肝星状细胞产生，而大量激活的肝星状细胞阻碍了MMPs的产生，间接促进了肝纤维化。可见，活化的肝星状细胞失活或减少是肝纤维化消退的关键。

在肝纤维化进程中，活化的肝星状细胞表面存在甘露糖-6-磷酸酯受体高度表达，该受体对甘露糖-6-磷酸修饰的人血清白蛋白(mannose-6-phosphate-human serum albumin，M6P-HSA)具有高亲和力。因此，M6P-HSA可以作为抗肝纤维化药物(己酮可可碱、甘草次酸等)的载体，其与肝细胞表面的甘露糖-6-磷酸酯受体相结合，从而让肝纤维化治疗药物被选择性地投放到肝星状细胞表面，最终达到靶向抗肝纤维化的目的[26]。有试验表明，将肾素-血管紧张素1型受体(angiotensin type 1 receptor，AT1受体)拮抗剂与M6P-HSA结合形成M6P-HSA-AT1受体拮抗剂，可以达到抗肝纤维化的目的[27]。因为在肾素-血管紧张素系统中，血管紧张素Ⅱ可通过刺激AT1受体直接活化肝星状细胞，引起ECM大量堆积，最终导致肝纤维化。因此，可以将M6P-HSA-AT1受体拮抗剂靶向作用于肝星状细胞表面，通过阻断肝星状细胞AT1受体，减少肝星状细胞中细胞间黏附分子-1和IL-8的表达，从而减缓肝星状细胞的活化，最终实现肝纤维化治疗[27]。目前，最常用的AT1受体拮抗剂为氯沙坦。有研究者用胆管结扎或四氯化碳所致的大鼠晚期肝纤维化模型评价该药的短期抗肝纤维化作用，结果显示，空白对照组、给药组的原胶原α2(Ⅰ)基因表达显著减少，表明其抗纤维化作用显著[27]。随后的组织分布实验结果显示，肺、脾、心肌、肾组织中均检测不到氯沙坦-M6P-HSA，只有肝非实质细胞中能够检测到[27]，提示氯沙坦是良好的靶向抗纤维化药物。

3.3靶向促进ECM降解和抑制胶原蛋白合成 ECM合成和降解由MMPs调控，而MMPs的活动由TIMPs调节。其中，肝星状细胞表达的TIMPs的主要成分为TIMP-1和TIMP-2[28]。有证据表明，在肝星状细胞活化期间及实验性肝纤维化进程中，几种常见MMPs的酶活性降低，产生这种现象的原因为TIMP-1的表达增加，阻碍了胶原蛋白的降解[12]。在人纤维化肝脏中，TIMP-1和TIMP-2的表达较正常肝脏高5倍[29]。由此可知，TIMPs表达的增加，ECM的合成和降解失调，使ECM往合成增加的方向发展，继而引起组织纤维化。

基于上述治疗靶标，Cong等[30]提出了构建以重组腺相关病毒为载体靶向作用于大鼠TIMP-1的小干扰RNA(recombinant Adeno-associated virus/small interfering RNA-tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1，rAAV/siRNA-TIMP-1)，并进一步证实了rAAV/siRNA-TIMP-1在大鼠肝纤维化模型中的作用。有学者对四氯化碳和胆管结扎两种大鼠肝纤维化模型给予rAAV/siRNA-TIMP-1治疗发现，肝胶原积累量、羟脯氨酸含量和肝脏及血清中Ⅰ型和Ⅲ型胶原浓度均降低[30]。此外，活化肝星状细胞的生物标志物α-平滑肌肌动蛋白和转化生长因子-β1(对肝纤维化的发展至关重要)的表达显著减少。可见，使用rAAV/siRNA-TIMP-1治疗显著减缓了四氯化碳和胆管结扎诱导大鼠的肝纤维化进程。有数据表明，rAAV/siRNA-TIMP-1是通过直接抑制TIMP-1的表达及增加MMP-13的活化来使ECM降解增多、合成减少，最终减轻肝纤维化[30]。可见，rAAV/siRNA-TIMP-1可能是一种有效的抗纤维化基因治疗剂。

此外，还可以通过抑制胶原蛋白的合成减少ECM，从而逆转肝纤维化。胶原蛋白是纤维化中ECM的主要成分，占肝硬化肝脏干重的50%[31]。来自中央结构的Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型胶原蛋白合成纤维丝，其他胶原蛋白、非胶原胶质蛋白和蛋白多糖直接或间接黏附于该合成纤维丝上形成各种ECM组件。目前，广泛使用的抑制Ⅰ型胶原蛋白(最丰富的瘢痕胶原蛋白)合成的方法存在一定危险，且无显著的抗纤维化作用，因为这种抑制可能导致器官功能障碍并有利于癌症生长。但通过使用优化的抗原胶原α1(Ⅰ)小干扰RNA脂质复合物，可以在体内实现特异性抑制Ⅰ型胶原蛋白的合成。这些脂质复合物的肠外应用导致毒素诱导和胆汁性肝纤维化小鼠模型中原胶原α1(Ⅰ)合成的减少大于90%，且当晚期肝纤维化开始治疗时，肝脏中总胶原蛋白的积累减少高达50%[32]。故推测，原胶原α1(Ⅰ)为肝纤维化的有效靶点。这在四氯化碳诱导的被敲除原胶原α1(Ⅰ)基因的小鼠中得到证实[33]。研究显示，载有抗原胶原α1(Ⅰ)小干扰RNA的脂质体复合物几乎完全由肝脏吸收，并在ECM中集中[32]。同时，使用抗原胶原α1(Ⅰ)小干扰RNA纳米水凝胶粒子复合物也得到类似结果[34-35]。

4 小 结

肝纤维化主要由炎症介质诱导肝星状细胞活化为肌成纤维细胞，导致ECM过量堆积形成。同时，通过对肝纤维化的分子机制的深入分析，可以发现逆转肝纤维化发生的环节和靶标，即靶向抑制炎症介质、肝星状细胞和TIMPs。但是，这些干预环节和靶标研究结果大多处于前瞻性研究阶段，故仍需要与人源性发病机制相结合，才能研发出疗效确切安全性高的抗肝纤维化药物制剂。目前用于治疗肝纤维化的药物已经取得了很大进展，有些已进入临床阶段，但是在晚期纤维化难以治疗的情况下，迫切需要探索载体技术改善肝纤维化的治疗策略。