非编码RNA与创面愈合的研究进展

宋建坤，蒯仂 ，茹意，罗楹，迮侃，李福伦，李欣，孙晓颖，李斌

(1.上海中医药大学，上海 201203； 2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院皮肤科，上海 200437)

皮肤是保护人体免受外界伤害的外在屏障，由表皮、真皮及皮下三层构成。皮肤受损后，真皮细胞对不同水平调控过程的协同作用是必不可少的[1]。创面愈合主要经历两个阶段：炎症期，各种炎症细胞浸润到伤口部位，清除病原体，分泌细胞因子和生长因子[2]；修复期，创面细胞外基质开始重建，包括血管生成、肉芽组织形成、胶原纤维沉积、上皮化和创面收缩，接着瘢痕组织成熟，Ⅲ型胶原被Ⅰ型胶原取代，创面愈合[3-4]。全基因组的转录组学研究表明，人类基因组被大量的非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)广泛转录，包括微RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和环状RNA(circular RNA，circRNA)[5]。ncRNAs是近年来发现的对细胞生理学和病理学具有重要作用的基因调控因子。ncRNAs占人类细胞转录产物的近60%，在发育和病理环境中ncRNA被证明可以调节细胞过程和通路[6]。ncRNAs参与创面愈合的全过程，研究ncRNAs与创面愈合之间的相互关系有助于更好地了解其在创面愈合中对信号通路的作用及调控机制，并为创面治疗提供新靶点。现就ncRNAs与创面愈合的研究进展予以综述。

1 miRNA与创面愈合

miRNA是一类在物种进化中相当保守，长度为18～25个核苷酸序列的小分子单链RNA。miRNA的转录初产物在细胞核内转录，被核糖核酸酶-脱氧核糖核酸酶切割成前体miRNA。输出蛋白5将前体miRNA运输到细胞质中，进一步切割形成成熟miRNA。之后，miRNA与RNA诱导沉默复合体结合形成siRNA诱导基因沉默复合物——miRNA复合物，作为翻译抑制剂降解靶mRNA，在转录后水平负性调控靶基因的表达。

1.1miRNA在创面炎症期的作用 炎症反应是愈合创面的首要条件，miRNA异常表达影响促炎与抗炎信号的精细调节，导致创面促炎/抗炎信号失衡，引起过度的慢性炎症影响创面愈合。慢性炎症反应也会影响角质形成细胞介导的上皮化进程(角质形成细胞的增殖、迁移等)，不利于启动后续的组织修复程序。在创面愈合的炎症阶段，白细胞通过受损的血管进入伤口，这是一种由化学引诱物介导的过程，如转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血小板衍生生长因子等。参与创面炎症期的miRNA主要有miR-155、miR-21、miR-146、miR-223、miR-203等。其中促进炎症反应的为miR-155，抑制炎症反应的有miR-21、miR-146、miR-223、miR-203。

miR-155是最早与Toll样受体配体、炎症细胞因子和特异性抗原诱导的炎症相关的miRNA之一。Yang等[7]在创面边缘注射miR-155拮抗剂，发现促炎因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、TNF-α减少，抗炎因子IL-10增加，下调miR-155可能通过减少难愈合创面过度的炎症反应，提高创面愈合质量。

miR-21是人类疾病中最常见的上调miRNA之一，在细胞增殖、分化、凋亡和上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)中发挥重要作用。miR-21促进成纤维细胞迁移，并使得生长因子分泌及其他细胞类型向创面迁移，从而加速糖尿病创面愈合过程[8]。Das等[9]研究发现巨噬细胞中miR-21的高表达促进了靶基因人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因的磷酸酶和重组人程序性细胞死亡4的分泌和沉默，诱导巨噬细胞产生更多的抗炎细胞因子IL-10，同时抑制炎症介质(TNF-α)的释放，促进创面凋亡细胞清除，加速创面愈合。

miR-146是巨噬细胞和树突状细胞中细胞因子和病原体产物(如脂多糖)诱导的miRNA之一。研究发现，miR-146a/b通过靶向泛素连接酶TNF受体相关因子6和IL-1受体相关激酶1负调控树突状细胞凋亡，减少促炎细胞因子IL-6、TNF-α的表达，抑制炎症的发展[10]。Xu等[11]研究发现miR-146a的低表达与糖尿病溃疡创面异常炎症反应有关。Zhou等[12]研究发现吞噬细胞和上皮细胞中的miR-223协同抑制上皮细胞中的经典核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途径，减少促炎因子和趋化因子的释放，从而起到控制炎症的作用。

TNF-α和IL-24是角质形成细胞系和原代角质形成细胞中miR-203的直接靶标，miR-203通过下调细胞因子信号转导抑制蛋白基因家族成员以及促炎细胞因子来微调或平衡细胞因子信号，创伤皮肤中miR-203的增加可能是抗炎反应的一部分[13]。Benakanakere等[14]研究发现，上皮细胞表面Toll样受体2的表达受miR-105表达的负调控，该机制可能降低炎症细胞因子的产生，减少炎症反应。

1.2miRNA在创面修复期的作用 创面修复期主要包括增殖和重塑两个阶段。增殖阶段主要涉及再上皮化和血管生成，重塑阶段与胶原蛋白的沉积至关重要。

1.2.1miRNA在增殖阶段的作用 在伤口愈合的情况下，EMT由细胞因子如TGF-β驱动，并且是角质形成细胞向创面中心迁移所必需的。在正常的伤口愈合中，该过程导致再上皮化。参与这一过程的miRNA主要有miR-21、miR-31、miR-155、miR-203、miR-204、miR-205、miR-210等。其中促上皮化的有miR-21、miR-31、miR-155，抑制上皮化的有miR-203、miR-204、miR-205、miR-210。

Yang等[15]研究发现，miR-21可能通过抑制组织金属蛋白酶抑制因子3和T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1的表达，促进角质形成细胞在体外迁移，促进创面在体内愈合。Li等[16]研究发现miR-31在伤口边缘化细胞中表达上调，通过抑制其靶基因上皮膜蛋白1，促进角质形成细胞增殖和迁移。此外，miR-31还能通过靶向Ras/促分裂原活化的蛋白激酶信号通路促进角质形成细胞迁移和增殖，因此miR-31是皮肤创面角质形成细胞从炎症阶段向再上皮化阶段转变的重要细胞内在调控因子[17]。miR-155通过上调基质金属蛋白酶-2的水平，加速角质形成细胞的迁移，促进创面愈合和再上皮化，且不影响创面收缩[18]。

miR-203是表皮中最丰富的角质形成细胞特异性miRNA，具有抗增殖作用。miR-203直接靶向转录因子p63，通过限制表皮干/祖细胞和角质形成细胞的增殖潜能和诱导细胞周期退出，促进表皮分化[19]。Deppe等[20]研究证实,下调miR-203可以加快角质形成细胞增殖和迁移的靶蛋白的表达，以改善损伤皮肤的再上皮化。miR-204在角膜上皮中高表达，但是在角膜创面愈合过程中表达下调。因此，下调miR-204可以促进上皮细胞的增殖和迁移，利于创面愈合[21]。miR-205在角质形成细胞迁移、再上皮化过程中起重要作用。有报道显示，miR-205的下调导致丝氨酸-苏氨酸激酶1的活性增加，肌动蛋白切断丝切蛋白的磷酸化，以及丝状肌动蛋白的相应减少，抑制角质形成细胞的迁移，延长创面的愈合[22]。Biswas等[23]发现在缺血性创面中出现大量缺氧诱导因子-1α，诱导miR-210表达，导致细胞周期调节蛋白E2F3表达下调，限制细胞增殖。在创面愈合过程中，miR-210下调可促进角质形成细胞的增殖，加快创面的闭合。

血管生成是增殖阶段的另一个特征。创面的血管分布与其愈合能力密切相关，通过在整个伤口愈合过程中提供支持组织再生的营养物，促进血管生成，对伤口愈合及预后至关重要。促血管生成的miRNA主要有miR-146a、miR-4530、miR-148b、miR-23a、miR-126、miR-424等。抑制血管生成的miRNA有miR-218、miR-200b、miR-1、miR-29b、miR-939、miR-21、miR-377等。

miR-146a除抑制促炎细胞因子释放外，还能增强血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。研究发现miR-146a通过靶向p21激活激酶1基因，刺激VEGF表达和血管分支的形成，促进新生血管的形成[24]。miR-4530具有刺激内皮细胞血管生成的能力。Zhang等[25]研究发现miR-4530可能通过抑制乳腺癌细胞中血管生成抑制蛋白的表达，从而促进血管再生。Miscianinov等[26]研究显示，在内皮细胞中miR-148b具有促进血管生成的重要作用，其抑制作用通过调控靶基因TGF-β2和母亲DPP同源物2(果蝇)(Smad)促进内皮-间充质转化的过程。上调miR-148b可增加内皮细胞的迁移、增殖和血管生成，加速创面的闭合，下调miR-148b可上调创面内皮-间充质转化表达，使得创面闭合受损。miR-23a通过抑制脯氨酰羟化酶1和2导致内皮细胞中缺氧诱导因子-1α的积累，促进血管生成。同时，miR-23a还抑制紧密连接蛋白闭锁小带蛋白，从而增加血管通透性，上调miR-23a可以促进血管再生，加快创面愈合[27]。Jansen等[28]发现miR-126通过内皮细胞微粒转运到受体人冠状动脉内皮细胞中，并调控靶蛋白SPRED1(EVH1 domain-containing protein 1)，促进血管内皮细胞的修复。miR-424靶向通过靶向Cullin 2蛋白，增加缺氧诱导因子-1α在细胞内的水平，抑制其蛋白酶体降解。升高的缺氧诱导因子-1α增加VEGF和人源葡萄糖转运蛋白的转录，表明上调miR-424可以促进血管形成[29]。

Zhang等[30]发现miR-218可能通过靶向ROBO1(细胞黏附分子免疫球蛋白超家族成员)基因介导血管丛破坏，抑制肿瘤的生长。同样地，在创伤愈合过程中，下调miR-218的表达能促进血管生成。miR-200家族通过控制细胞迁移和极性，在EMT过程中起重要作用。Chan等[31]发现miR-200b负调控人微血管内皮细胞中的Ets-1相关基因，即基质金属蛋白酶-1和VEGF受体2，下调miR-200b能够促进血管生成。miR-21能够抑制内皮细胞的增殖和迁移，是一种强有力的抗血管生成因子[32]。Xie等[33]研究发现下调miR-1可以激活血管生成前信号通路，促进VEGFA的表达，刺激血管内皮细胞的增殖和迁移。有研究报道，miR-29b通过靶向蛋白激酶3抑制乳腺癌细胞中VEGF和c-myc的表达，证明了miR-29b在抗血管生成和抗肿瘤发生中的作用[34]。另一项研究表明miR-29b的过表达通过靶向信号转导及转录激活因子3信号通路抑制宫颈癌细胞的体外侵袭、EMT过程和血管生成，抑制肿瘤生长和体内新生血管形成[35]。在创面愈合过程中，miR-29可能通过靶向蛋白激酶3和信号转导及转录激活因子3信号通路抑制新生血管生成。miR-939在人脐静脉内皮细胞过表达显著抑制细胞增殖、黏附和成管，通过直接靶向γ联蛋白来消除血管完整性并抑制血管生成[36]。在创面愈合中，下调miR-939可以促进内皮细胞增殖和血管生成。体内外的研究均证实过表达miR-377可以抑制食管癌的生长和血管生成[37]。同样，下调miR-377可能通过直接结合其3′非编码区来调节CD133和VEGF，促进血管形成。

1.2.2miRNA在重塑阶段的作用 伤口愈合的重塑阶段涉及组织的胶原沉积，与瘢痕的形成和成熟密切相关。Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,Col1)是细胞外基质的主要组成部分，其无序积累可导致瘢痕形成。参与重塑阶段的miRNA主要有miR-98、miR-141-3p、miR-29b、miR-185等。

Bi等[38]用miR-98模拟物转染成纤维细胞后，Col1α1基因表达显著下降，导致细胞活力下降和细胞凋亡增加，用miR-98抑制剂转染细胞，结果相反。因此，下调miR-98可以促进皮肤成纤维细胞中的Col1α1基因表达，加快创面愈合。生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1是miR-141-3p的直接靶点，其在瘢痕组织中表达上调。研究发现miR-141-3p通过抑制接头蛋白1表达降低皮肤成纤维细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡，下调miR-141-3p诱导成纤维细胞分泌胶原，促进创面愈合[39]。miR-29b及其家族成员(miR-29s)主要通过调节细胞外基质代谢参与创伤愈合和组织纤维化，通过抑制TGF-β1/Smad/结缔组织生长因子信号转导途径，减少过度瘢痕形成[40]。Zhu等[41]研究发现miR-29b可能通过转录后抑制热激蛋白47的表达，在皮肤创伤愈合过程中降低胶原合成和血管生成。因此，下调miR-29b能诱导胶原合成，促进创面愈合。Xiao等[42]研究发现过表达的miR-185可以抑制成纤维细胞的生长，其潜在机制可能是通过抑制TGF-β1和Col1的表达来介导的。

2 lncRNA与创面愈合

lncRNAs是一类长度超过200个核苷酸的非蛋白编码转录本。由于具有结合DNA、RNA和蛋白质的能力，其作用机制可大致分为：①转录活性的分子信号；②内源诱饵结合并降低其他调节RNA的可用性或蛋白质；③指导染色质修饰复合物定位到靶DNA；④蛋白质和转录物结合的结构支架[43]。

2.1lncRNA在创面炎症期的作用 参与创面炎症期相关分子(如NF-κB、TNF-α、IL-6)表达调控的lncRNA主要有lncRNA-环加氧酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)、Lethe、肺腺癌转移相关转录子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)、lnc1992 THRIL、lnc-IL7R等。其中促进炎症反应的有lncRNA-COX2，抑制炎症反应的有Lethe、MALAT1、lnc1992 THRIL、lnc-IL7R。

Hu等[44]发现lncRNA-COX2在活化的巨噬细胞中的作用机制涉及形成含有lncRNA-COX2的染色质重建复合物，所得到的复合物被募集到晚期炎症基因的启动子/增强子区域，调节NF-κB向复合物的募集，触发染色质重塑，并最终导致获得NF-κB结合和基因转录的位点。

Lethe是一种假基因lncRNA，受NF-κB亚基RelA[v-rel网状内皮增生病毒癌基因同源物(禽)]调控。在小鼠胚胎成纤维细胞中，lncRNA Lethe可能通过直接与RelA同源二聚体结合，阻断RelA结合DNA的能力，从而起到抑制NF-κB的效应，发挥抗炎作用[45]。MALAT1是一种高度保守的lncRNA，敲除MALAT1可以增加脂多糖诱导的TNF-α和IL-6的表达[46]。在细胞核中，MALAT1与NF-κB的亚基p65和p50相互作用以抑制其DNA结合活性，从而减少促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达，抑制炎症的发生[46]。lnc1992 THRIL又称TNF-α和异构核L核糖核蛋白相关的免疫调节lncRNA，它可以调节人类巨噬细胞对先天刺激的反应。THRIL通过感应TNF-α、IL-6、IL-8和CXC趋化因子配体10的表达调节Toll样受体1/2激动剂的效能，Toll样受体1/2激动剂受到刺激后，THRIL通过与人源全长重组蛋白形成RNA蛋白复合物，负调控TNF-α表达[47]。

lnc-IL7R能够减少脂多糖诱导的炎症反应，对血管细胞黏附分子-1、IL-6及IL-8具有负调节作用，通过削弱组蛋白H3的N端赖氨酸残基K27甲基化，从而阻断炎症介质的近端启动因子对炎症反应进行调节[48]。

2.2lncRNA在创面修复期的作用

2.2.1lncRNA在增殖阶段的作用 创面增殖期以血管内皮细胞增殖与角质形成细胞的增殖和迁移为主要表现。参与增殖阶段的lncRNA主要有MALAT1、LINC00323-0、lncRNA-H19、lncRNA ANRIL(antisense non-coding RNA in the INK4 locus)、母系表达基因3(materally expressed gene 3，MEG3)等。其中促上皮化的有MALAT1、LINC00323-003、lncRNA-H19、lncRNA ANRIL，抑制上皮化的有MEG3。

MALAT1由TGF-β诱导，是内皮细胞增殖的重要介质。在体外与体内实验中，抑制内皮细胞中MALAT1均可减少内皮细胞的增殖，导致血管生长缺陷，表明MALAT1对内皮细胞、血管生成具有促进作用[49]。缺氧是一种强有力的促血管生成刺激物，并在内皮细胞中诱导VEGF介导的信号转导。LINC00323-003对缺氧高度敏感，对内皮细胞的血管生成至关重要，下调lncRNA会导致离体诱导的基于多能干细胞的三维工程人心脏组织模型中的血管形成受损[50]。Tao等[51]发现lncRNA-H19的降低与糖尿病血管生成损伤之间可能存在通过阻断lncRNA-H19而导致胰岛素-磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B通路受损的关系。Zhang等[52]发现过表达的lncRNA ANRIL通过激活NF-κB信号转导途径上调VEGF并促进血管生成。

MEG3是一种母系印迹基因编码的lncRNA，Su等[53]发现MEG3水平与VEGF水平呈负相关，提示MEG3可能通过p53途径抑制VEGF的表达。因此，下调MEG3可以促进血管生成。

2.2.2lncRNA在重塑阶段的作用 在这一阶段，成纤维细胞合成胶原纤维尤为重要，TGF-β、IL-4对胶原合成有明显的促进作用[54]。参与调控胶原合成及瘢痕形成的lncRNA主要有lncRNA8975-1、lncAC097662.2、lncRP11-586K2.1、lncRNA8975-1、lncRNA Col1α2-AS1等。

lncRNA8975-1、AC097662.2和RP11-586K2.1分别与Col1α2、Col4α3和基质金属蛋白酶-16基因相关，参与趋化因子和TNF信号通路，可能影响胶原蛋白的合成或降解[55]。lncRNA AC067945.2的过表达下调皮肤成纤维细胞中的胶原蛋白表达，并可能与VEGF和Wnt信号通路相关[56]。Li等[57]通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应分析发现lncRNA8975-1 在增生性瘢痕组织和真皮成纤维细胞中过表达。lncRNA8975-1过表达抑制增殖性瘢痕成纤维细胞中Col1α2、Col1α1、Col3α1和α-平滑肌肌动蛋白的细胞增殖并降低其蛋白表达水平，表明下调lncRNA8975-1可以促进成纤维细胞的增殖。Nong等[58]研究发现lncRNA Col1α2-AS1在增生性瘢痕组织和成纤维细胞中上调，通过促进Smad7表达抑制成纤维细胞增殖，同时也证实了miR-21参与lncRNA Col1α2-AS1诱导的Smad7表达，Col1α2-AS1作为内源性海绵吸附miR-21，进而调节Smad7和分子级联，在增生性瘢痕中发挥保护作用。

3 circRNA与创面愈合

circRNA是由mRNA前转录本的非序列反剪接形成的，在真核细胞中广泛表达。它们最近被确定为多种生理和病理过程中的关键调节因子，通常作为miRNA海绵起作用，并参与miRNA介导的转录后调控网络的组成。此外，circRNA还具有与RNA结合蛋白相互作用、调节mRNA的稳定性、调控基因转录、翻译蛋白等功能。

3.1circRNA在创面炎症期的作用 circRNA 0044073、circARF3、circRNA_Atp9b是具有促炎作用的circRNA，下调其表达有利于减少创面炎症反应。

circRNA 0044073的过表达促进了人血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的增殖，有利于Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号转导途径和炎症的激活[59]。有证据显示，Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号通路通过IL家族、干扰素家族及生长抑素影响巨噬细胞、T细胞，从而参与创伤愈合过程。circARF3作为内源性miR-103海绵起到抑制miR-103活性的作用，导致TNF受体相关因子3表达增加，而TNF受体相关因子3能够阻断NF-κB信号转导途径，促进NOD样受体蛋白3炎症小体激活和炎症细胞因子释放[60]。Zhou等[61]用IL-1β刺激小鼠软骨细胞后，发现circRNA_Atp9b表达显著上调，敲低circRNA_Atp9b则促进了Ⅱ型胶原的表达，同时抑制了基质金属蛋白酶-13、COX-2和IL-6的产生，表明circRNA_Atp9b通过海绵miR-138-5p调控细胞外基质分解代谢和炎症。

3.2circRNA在创面修复期的作用

3.2.1circRNA在增殖阶段的作用 circANRIL与雌激素受体共调节因子抗体同源物1结合，损害核酸外切酶介导的前核糖体RNA加工和血管平滑肌细胞和巨噬细胞中的核糖体生物合成。研究显示，circANRIL可诱导核仁应激和p53活化，进而增加细胞凋亡，降低增殖率[62]。

功能性研究发现，上调circRNA-肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MYLK)可以促进细胞增殖和迁移，在体内外诱导EMT和血管生成，而下调circRNA-MYLK则相反。在机制上，circRNA-MYLK和VEGFA的非编码区具有相同的miR-29a反应元件，与miR-29a竞争性结合，通过拮抗miR-29a调控VEGFA的表达[63]。VEGFA还通过激活TGF-β信号，NF-κB和β联蛋白途径促成EMT的发生。因此，上调circRNA-MYLK可以促进细胞增殖和血管生成，加快创面的修复。

3.2.2circRNA在重塑阶段的作用 实验表明，circRNA_010567沉默可以上调miR-141，下调TGF-β1的表达，并抑制成纤维细胞中纤维化相关蛋白切除，包括Col1、Col3和α-平滑肌肌动蛋白，因此上调circRNA_010567可以促进胶原生成[64]。Yang等[65]通过动物实验、聚合酶链反应和细胞迁移实验等发现circ-Amotl1的表达加速了成纤维细胞的增殖和迁移，进一步的机制研究发现异位circ-Amotl1可以增加信号转导及转录激活因子3和DNA甲基转移酶3A的蛋白水平，增加纤维连接蛋白的表达，从而促进创面的愈合。

4 展 望

人类基因组大多是由ncRNAs组成，ncRNAs在创面愈合过程中扮演重要角色，参与调节炎症反应、再上皮化、血管生成和瘢痕形成，有望成为创面愈合的生物标志和治疗靶点。目前miRNA在创面愈合中的机制研究相对成熟，而lncRNA与circRNA对创面愈合的调控机制尚处于初始阶段，有待进一步体内外实验及功能验证。进一步研究ncRNAs在创伤愈合中各个阶段的作用，并筛选其靶基因，将成为研究者今后努力的目标。更好地理解创伤愈合的分子机制可能为慢性创面提供更好的治疗和先进的解决方案。