革兰阴性菌包膜应激反应系统的调控机制及对致病性的影响

陈洁，黄健,2，闵迅,2

(1.遵义医科大学检验医学院，贵州 遵义 563000； 2.遵义医科大学附属医院医学检验科，贵州 遵义 563000)

革兰阴性菌的包膜由内膜、含有薄层肽聚糖的周质以及外膜组成。包膜是细菌与外环境之间的机械屏障，可对抗外界环境条件变化对细菌的影响；同时，包膜也是细菌与外界进行物质交换的通道(如营养物质摄取、有害产物排出)；此外，包膜还是许多物质代谢过程发生的重要场所[1]。因此，包膜结构和功能的完整性对于维持细菌的生命活动非常重要。不利的外部环境，如高温、高pH、宿主致病环境等，可破坏细菌包膜结构或者周质稳态，影响包膜蛋白运输、折叠和组装等过程，从而影响细菌生存[2]。此时，包膜可感知这些环境信号，启动一系列的包膜应激反应，调节包膜合成过程，以对抗相应的压力。包膜应激反应系统主要包括环境信号感知蛋白、信号转导途径的激活组件和下游的效应分子。细菌内存在多个包膜应激感应系统，以帮助细菌应对不同的压力环境；另外，包膜应激反应系统还可通过调控细菌的生存以及毒力因子的表达，进而影响细菌的致病性。现就革兰阴性菌包膜应激反应系统的调控以及对细菌致病性的影响予以综述。

1 包膜应激反应的压力来源

1.1外部环境改变对包膜的影响 包膜应激反应系统的主要功能是应对外部环境条件变化对细菌的影响。许多外环境变化均可引起包膜结构的改变，成为包膜应激反应的激活因素，包括温度改变、pH改变、渗透压改变以及不利的氧化还原状态等。例如，低温环境条件可减缓包膜成分的生物合成和蛋白质的折叠，并降低细胞膜的流动性[3]。而这些包膜的改变可以作为直接或间接信号启动应激反应，应激反应的总体效应是提高包膜蛋白质的质量控制，以对抗包膜中发生的低温诱导现象[2]。此外，营养限制导致的包膜破坏也会激活包膜应激反应系统。在缺乏关键营养因子的情况下，营养缺陷菌不能合成某些包膜成分，导致包膜结构改变，进而激活包膜应激反应，如氨基酸生物合成突变体不能合成某些特定蛋白质等[4]。微量元素对于某些包膜成分的合成也是必不可少的，如缺铁环境可以导致蛋白质的错误折叠和内膜的解离，从而激活包膜应激反应[5]。

1.2毒性分子和抗生素对包膜的影响 细菌生长环境中一些有毒分子可破坏包膜，引起包膜反应系统的激活。例如，包膜暴露于高水平的金属离子中(如铜离子或锌离子)，受到天然金属的氧化损伤[6-7]。此外，某些直接或间接破坏包膜的抗生素也会激活应激反应，以试图修复包膜损害[8-9]。在致病菌进入宿主建立感染过程中，宿主针对细菌感染的防御机制(如分泌抗菌肽破坏细菌外膜和内膜的完整性)可导致包膜破坏和压力反应的激活[10]。此外，暴露在胆盐中的肠道细菌也会破坏细胞膜[8-9]。

1.3内源性毒素产生对包膜的影响 除外源性毒性分子外，细菌在生长和代谢过程中也会产生一些内源性毒性分子和毒性代谢产物，它们同样会损伤包膜。例如，特定氨基酸缺乏或蛋白翻译突变会导致错误翻译的增加，错误翻译的多肽会造成蛋白错误折叠，而未折叠或错误折叠的蛋白在包膜的聚积会激活包膜应激反应[11]；另外，细菌代谢过程中产生的活性氧类或代谢中间体也会对包膜产生损伤[12]。综上，细菌生存环境的改变以及外源性毒性分子、内源性毒性产物均可能成为破坏包膜稳态的因素。因此，包膜应激反应的信号来源十分广泛，需要多种包膜应激反应系统在多变环境中尽可能地感知压力信号，并做出及时反应。

2 常见的包膜应激反应系统及其调控机制

2.1主要的外膜应激反应系统——σE系统 σE(包膜压力σ因子)应激反应系统的激活信号主要是周质中积聚的未折叠外膜蛋白以及结构异常的脂多糖，如脂多糖乙酰化不足以及核心多糖的截短等[13]。此外，紫外线辐射也是σE系统的激活信号[14]。σE应激反应是一个蛋白水解级联反应过程，当σE反应没有被诱导时，σE与抗σ因子RseA结合，阻止了σE激活目标基因的转录[15]。当发生压力响应时，周质中未折叠的外膜蛋白与内膜上的丝氨酸蛋白酶DegS结合，引起DegS蛋白酶构象变化成为有活性的DegS，激活的DegS蛋白酶能够切割抗σ因子RseA，去除RseA周质结构域[12]。在未激活状态下，结合到RseA的周质结构域的RseB可以抑制DegS对RseA的切割，而在激活条件下这种抑制会被解除[16]。DegS切割RseA的周质结构域会促使蛋白酶RseP能够在跨膜区内进行RseA的第二次切割，从而促进可溶性小片段RseA和σE的释放；可溶性小片段RseA在胞质内被蛋白酶去除，释放游离的σE，游离σE与RNA聚合酶结合并激活其调节子，导致σE应激系统的激活，当σE系统激活时，σE依赖的基因得以转录，从而上调外膜蛋白折叠通路[17]。主要的调节因子包括周质中维持外膜蛋白在未折叠状态的周质伴侣、负责将外膜蛋白插入外膜的BAM(β-barrel assembly machinery)复合体的成员以及降解未折叠外膜蛋白的周质蛋白酶等[18]。另外，σE还会增加减少外膜蛋白合成的两种小RNA分子(MicA和RybB)的转录[19]。以上调控可达到上调外膜蛋白的折叠装置以及质量控制因子，同时减少新的外膜蛋白合成以达到重建外膜蛋白稳态的目的。

2.2主要的内膜应激反应系统——CpxRA双组分系统 σE反应系统主要响应于外膜压力，而Cpx(conjugative plasmid expression)系统主要感知内膜压力。Cpx系统的激活信号是内膜蛋白的分泌缺陷以及分泌的内膜蛋白或周质蛋白的错误折叠。导致上述改变的压力来源包括pH的增加、渗透压的改变、细菌对疏水表面的黏附、肽聚糖生物合成的缺陷、乙醇暴露以及磷脂组成改变等[20-22]。Cpx应激系统是一个典型的双组分系统，由感受压力的组氨酸激酶CpxA和反应调节子CpxR组成。CpxA与其他大多数激酶一样，既具有激酶活性也有磷酸酶活性[23]。在非诱导条件下，CpxA发挥其磷酸酶活性将CpxR维持在非磷酸化的状态，阻止其发挥作用；而在诱导条件下，CpxA的周质段感受结构域发生结构改变，导致CpxA的胞质组氨酸激酶结构域自磷酸化，然后将其磷酸基团传递至CpxR的受体结构域，从而激活CpxR，进行转录调节[24]。CpxP基因是CpxR激活后受到强烈转录调控的基因之一，CpxP又可通过负反馈机制抑制CpxA的活化[25]。

2.3Rcs(regulator of capsule synthesis)应激反应系统 Rcs系统响应于脂多糖的电荷改变或结构改变、肽聚糖合成改变以及脂蛋白运输缺陷，同时也受到膜来源寡糖缺失的影响[2]。这些压力均可被Rcs系统的压力感受分子RcsF所感知。RcsF是一个外膜脂蛋白，具有独特构象，其N端的脂化残基位于外膜的外表面，连接结构域穿过外膜蛋白，信号结构域定位于周质中[26]。其中，穿过外膜蛋白的RcsF螺旋结构部分可能负责感知肽聚糖的缺陷，而RcsF在内膜的聚集则可以感知脂多糖运输的缺陷[27]。研究表明，RcsF通过其带正电荷的残基与细胞表面脂多糖的带电荷残基的结合感知发生电荷改变时脂多糖的缺陷[28]。

在非激活条件下，Rcs系统活性受IgaA抑制调控，IgaA是一种内膜蛋白，它可以与组氨酸激酶RcsC结合以阻止RcsC的自磷酸化；还可以与磷酸转移酶RcsD结合，阻止RcsD对反应调节子RcsB的磷酸化[29]。当RcsF被激活时，RcsF与IgaA发生物理结合，并且其抑制信号传递被阻止，此时组氨酸激酶RcsC可以自磷酸化，然后磷酸化RcsD，进而磷酸化RcsB，最终激活RcsB进行转录调控[30]。RcsB可以作为同源二聚体或与其他反应调控子(如RcsA)组成异源二聚体共同调节转录[29]。由RcsBB同源二聚体引起的最明确的调控改变是小RNA分子RprA的上调，RprA可增加RpoS的翻译，RpoS作为稳定生长期的替代σ因子能针对多种压力，与其他系统共同为细菌提供保护作用[31]。RcsAB异源二聚体可以增加可乐酸胶囊合成基因以及生物膜形成相关基因的表达，同时减少鞭毛合成调节子的表达[32-33]。此外，Rcs系统中还有许多成员的功能仍然未知，需要进一步研究。

2.4Psp(phage shock protein)应激反应系统 Psp应激反应系统在内膜遭受极度破坏而导致质子驱动力缺失的情况下被激活[34]。这种内膜破坏的程度比激活Cpx系统所需的内膜破坏程度更严重。引起严重内膜破坏的因素包括丝状噬菌体感染、极度热休克、渗透休克、乙醇暴露、有机溶剂暴露以及外膜蛋白在内膜定位等[35]。在非诱导条件下，PspA与PspF的结合抑制了调节子PspF的活性，内膜蛋白PspB和PspC被认为是Psp系统的压力感受分子，同时，PspA也可以直接感受某些压力信号[36]。当压力感受分子被激活时，PspB和PspC与PspA相结合，释放PspF，而PspF是一个增强子结合蛋白，它特异性地与含有σN的RNA聚合酶结合以增强PspA、PspB、PspC、PspD、PspE、PspG基因的转录；除了与PspF相互作用外，PspA还可以与内膜的内面结合，从而阻止质子泄露[37]。另外，PspB和PspC还可以直接阻止促胰液素的毒性作用[38]。

2.5Bae(bacterial adaptive response)应激反应系统 Bae应激反应可以被多种毒性分子激活，包括乙醇、钨酸钠、吲哚、锌等。Bae系统是一个典型的双组分系统，BaeS是负责磷酸化BaeR的传感器组氨酸激酶，而BaeR是反应调节子[39]。当BaeR被磷酸化时，上调了一个小的调节子，导致Spy(一种周质伴侣蛋白)、许多外排泵、部分未知功能的蛋白以及BaeS和BaeR的水平增加，该系统在细菌暴露于毒性分子的情况下，通过增加外排作用保护细菌[40]。

革兰阴性菌中的包膜应激系统还有很多，它们涉及不同的蛋白分子及调控机制。但几乎所有包膜应激反应的模式都是一致的，首先感知压力信号，然后信号通过级联下传，最终调节效应分子的基因转录水平。每种包膜应激系统所响应的压力信号都不是唯一的，而是某一种或者几种类别。同时，不同的包膜应激系统之间的激活信号既交叉又互补。包膜应激反应的效应机制也多种多样，涉及包膜蛋白的质量控制、毒性分子的外排、毒力因子的调节等，其总体效应是维护细菌在各种压力条件下的生存与适应性。

3 包膜应激反应系统对细菌致病性的调控

3.1σE系统对细菌致病性的调控 σE系统与细菌致病性的关系得到了充分的研究。与相应野生株相比，σE缺失突变菌会出现细菌活性降低、毒力减弱的情况，这在沙门菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌、耶尔森菌中均有报道[41]。σE参与了细菌鞭毛合成的调控，在非伤寒沙门菌中，σE通过激活抗FlhC2D4(鞭毛合成主要调节子)复合因子RflP(anti-FlhDC factor)，将FlhC2D4靶向ATP依赖的ClpXP蛋白酶，使其降解，从而下调鞭毛合成以帮助细菌逃避宿主免疫系统[42]。在伤寒沙门菌中，由于肠腔内渗透环境的改变，σE通过上调鞭毛合成调控基因fliA而增加动力，以帮助细菌对肠道的侵袭[43]。σE系统针对细菌同一特性同时存在上调和下调，可能是由细菌感染的不同定位引起的压力信号的差异决定的，说明σE系统会根据具体压力信号的不同，采取不同的调控机制，以达到增加细菌在环境中适应性的目的。

除了对动力的调控，σE系统的效应还涉及细菌的侵袭、黏附和定植能力。在沙门菌中，σE缺失突变体通过抑制编码Ⅲ型分泌系统沙门菌致病岛-1和沙门菌致病岛-2基因的表达减弱其侵袭能力[44-45]。SurA基因的缺失同样可以造成细菌侵袭能力减弱，而SurA也受到σE的调控[46]。肠致病性大肠埃希菌是婴儿腹泻的主要原因，它与肠上皮细胞的黏附能力是其发病机制的核心[47]。σE调节的伴侣蛋白SurA、DegP和Skp是将黏附素插入外膜所必需的[48]。在大肠埃希菌中，σE调控导致鞭毛和Ⅰ型菌毛的表达减少，可以减弱细菌的黏附和侵袭能力[49]。对耶尔森菌的研究则表明，伴侣蛋白SurA是细菌黏附至Hela细胞所必需的[50]。σE调节的伴侣蛋白DegP和Skp对于泌尿系致病性大肠埃希菌的尿路定植非常重要[51]。黏附、侵袭和定植能力都是革兰阴性菌重要的毒力因子。σE系统对细菌致病性的调节涉及多种毒力因子，通过多种不同的机制影响与细菌侵袭、黏附、定植相关的蛋白的表达。

随着研究的进一步深入，发现σE不仅可以调控蛋白分子，还可以调节小RNA分子，例如，在沙门菌中，可通过上调小RNA分子MicA，促进生物膜形成[52-53]。在霍乱弧菌中，σE所调控的小RNA分子VrrA，除了可以影响生物膜的形成外，还可以促进外膜囊泡的形成[54]。另有研究表明，σE调节的分裂相关脂蛋白YraP有助于外膜的完整性，并可帮助提高细菌感染小鼠的能力，与野生型细菌相比，YraP基因突变株感染小鼠时，其毒性作用显著减弱，特别是在肝脏[55]。由此可见，σE的效应分子具有多样性，其效应分子包括蛋白、小RNA和脂蛋白。

3.2Cpx系统对细菌致病性的调控 Cpx应激反应系统可以通过多种机制影响细菌致病性。缺失CpxR基因会导致小鼠中大肠埃希菌的严重定植缺陷[56]。CpxRA基因缺失的大肠埃希菌在小鼠和斑马鱼模型中的定植和毒力均减弱[57]。在啮齿柠檬酸杆菌中，CpxRA基因的缺失同样导致细菌在小鼠体内的定植能力减弱[58]，这与σE系统的调控效应具有一致性。然而，Cpx系统与σE系统所感受的压力信号不同，调控的具体分子机制也不相同。从分子水平上看，Cpx系统可以调控定位于包膜的蛋白复合体，如肠致病性大肠埃希菌Ⅳ型菌毛，它在包膜上组装，并在与宿主细胞的黏附过程中发挥关键作用，过表达菌毛的PapE和PapG亚基激活Cpx反应，表明Cpx反应特异性地监控菌毛组装[59]。除了对菌毛的调节外，Cpx系统还对鞭毛蛋白和重要的毒力因子Ⅲ型分泌系统发挥调节作用[60]。

对大肠埃希菌中Cpx调节子的研究表明，Cpx应激反应可以上调细胞壁修饰相关基因，激活Cpx系统，增加了由LdtD(L,D-transpeptidase)形成的二氨基苯甲酸DAP-DAP交联，表明Cpx激活对肽聚糖的结构组成有直接的影响[61]。研究表明，缺失CpxR会增加细菌对抗生素的敏感性，CpxR可以调节pgtE，pgtE基因编码的外膜蛋白酶可以切割和抑制抗菌肽的活性，因此通过剔除CpxR基因能增加细菌对多黏菌素的敏感性[62-63]。可见，Cpx反应不仅在监控包膜中的蛋白质质量控制方面发挥了作用，而且也是维持细胞壁完整性的调控因素。

Cpx系统在霍乱弧菌肠道感染过程中帮助细菌适应低铁环境所带来的压力，Cpx调节子包含铁摄取与铁代谢相关的基因，如血红素吸收相关基因、铁运输载体相关基因等[64]。在缺铁培养基中补充硫酸亚铁可以减少Cpx系统的激活，Cpx系统对铁摄取和运输的影响与Cpx系统对霍乱弧菌中耐药结节分化外排泵的调控相关[65]。Cpx系统并不局限于上述几种细菌，相关的研究还涉及奈瑟菌、耶尔森菌、志贺杆菌等[66-67]。

4 小 结

革兰阴性菌的包膜结构为细菌提供了对环境压力和包括抗生素在内的毒性分子极强的抵抗力。包膜应激反应作为细菌维持包膜完整性、修复包膜损害并维持包膜稳态的机制必不可少。另外，包膜应激反应在对抗压力的过程中对细菌致病性发挥着重要的调控作用。这些调控涉及革兰阴性菌重要的毒力因子，也包含细菌维持包膜稳态所需的周质伴侣蛋白、定位于包膜的蛋白复合体，甚至还包括细胞壁修复相关蛋白等。了解包膜应激反应的具体机制，尤其是与致病菌的致病性相关的分子和调控过程，能够为细菌感染的治疗提供新的靶点。