角膜缘干细胞缺乏的临床诊断及手术治疗进展

潘玉苗，杨燕宁

(武汉大学人民医院眼科中心，武汉 430060)

角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency，LSCD)是由于角膜上皮干细胞或前体细胞在数量上和(或)功能上的降低而导致角膜上皮正常动态平衡不能维持的眼表疾病[1]。临床上表现为角膜缘屏障功能受损，甚至角膜上皮的结膜化，最终可导致角膜盲。LSCD的准确诊断至关重要，因为正确的诊断以及对角膜缘受累范围的评估是制订治疗策略的基础。以往对LSCD的诊断主要依据病史及临床表现[2]，但是对于临床体征的解释存在一定的主观性。随着眼部成像技术及分子诊断标志物的发展，LSCD的诊断进入了一个新时代。LSCD可单眼发病也可双眼发病，受累的角膜缘干细胞可以是部分也可以是全周。部分LSCD可局限于角膜的一个或多个部分，当中央角膜不受累时可采取保守治疗策略；而对于全周LSCD无论是单侧还是双侧，通过手术干预来替换受损或缺失的干细胞可能是目前唯一的治疗方法[3]。在目前的几种角膜缘干细胞移植技术中，自体角膜缘干细胞移植是最佳的方法，但供体组织的匮乏以及对自身健眼的损害使其发展受到一定限制。现就LSCD的临床诊断及手术治疗进展予以综述。

1 LSCD的诊断方法

1.1传统诊断方法

1.1.1临床表现及裂隙灯显微镜检查 LSCD患者的症状主要与角膜上皮愈合不良和复发性角膜上皮缺损相关，如眼红、视力下降、畏光、异物感、流泪、眼睑痉挛和疼痛等[1]，但这些症状均具非特异性，不足以明确诊断。LSCD的体征主要包括角膜上皮的结膜化、持续性或复发性上皮缺损、伴或不伴眼表新生血管及眼表炎症以及瘢痕形成等，其中角膜上皮的结膜化是诊断最具特异性的指标[4]。角膜上皮荧光素染色可见异常的上皮变薄甚至螺纹样上皮改变，另外Vogt栅栏的丢失也是LSCD的一种表现，但角膜缘区域Vogt栅栏结构差异较大，同一患者角膜缘的Vogt栅栏在上下角膜缘数量最多且显著，在鼻侧及颞侧数量最少[5]，并且Vogt栅栏的丢失也与年龄有关[6]。因此，在诊断中缺乏一定的特异性。

1.1.2印迹细胞学 印迹细胞学是一种简单、无创的技术，可检测角膜表面的杯状细胞和结膜上皮细胞。角膜上存在结膜杯状细胞是LSCD角膜上皮结膜化的有力证据，目前认为是诊断LSCD的“金标准”，但对于病变早期或结膜化程度轻微者缺乏灵敏度[7]。此外，在某些眼表疾病晚期也会出现完全角化，如Steven′s Johnson综合征患者结膜杯状细胞可能完全缺失，通过印迹细胞学无法检测到[8-9]。因此，阳性印迹细胞学结果可以确诊，而阴性结果不能排除该诊断。

1.2成像技术诊断方法

1.2.1体内激光扫描共聚焦显微镜(in vivo laser scanning confocal microscopy，IVCM) IVCM可在细胞水平观察LSCD患者角膜及角膜缘的微观结构改变。Vogt栅栏早期呈轻度形态改变，晚期结构完全消失[10]。角膜上皮结膜化的表现是角膜上出现杯状细胞，但目前对杯状细胞形态特征的认识还存在争议，一些报道认为杯状细胞的细胞质呈高反射性[11-12]，也有研究认为呈低反射性[13]，造成此现象的原因可能与杯状细胞的分泌状态不同有关。在LSCD的诊断方面，IVCM与印迹细胞学诊断具有较高的一致性(90%)(Kappa=0.85)[12]。近年来，随着成像技术的发展，已有研究利用IVCM评估LSCD的严重程度，如在LSCD早、中期，上皮基底细胞密度和基底神经密度显著减小，而晚期正常基底细胞形态完全丧失，基底神经不可见[10]。亦有研究利用IVCM早期诊断以及角膜上皮及角膜缘微结构的改变来监测疾病的进展，结果发现，IVCM上LSCD的微观结构改变要早于临床表现，且基底细胞密度降低程度、中央区角膜上皮和角膜缘上皮变薄程度均与疾病严重程度呈正相关[14-15]。目前已有学者基于临床表现及IVCM观察提出了新的LSCD临床评分系统[16]，有望对LSCD进行准确的临床分期，便于监测疾病的进展及治疗。

1.2.2前段光学相干断层扫描(anterior segment-optical coherence tomography，AS-OCT) AS-OCT是一种快速、简便、非接触式的角膜成像技术，主要用于分析各种眼表疾病角膜上皮厚度变化。超高分辨的AS-OCT使角膜缘的Vogt栅栏、血管、淋巴管和神经纤维结构可视化，协助LSCD病情评估，同时使角膜缘干细胞移植取材更具针对性[17-18]。有研究表明，AS-OCT上LSCD患者受累区域角膜及角膜缘上皮变薄，且上皮变薄程度与疾病严重程度相关[19]，同时也可看到Vogt栅栏及角膜缘隐窝消失[1,20]，但同样存在年龄和检查部位的差异。此外，随着OCT技术的发展，血管造影技术使得角膜-巩膜组织形态结构可视化，可评估LSCD角膜新生血管形成[21-22]。由于角膜新生血管不是LSCD的特异性征象，OCT血管造影在LSCD诊断中的应用价值有限，但它可能是量化LSCD角膜新血管形成的重要工具。

1.3分子生物学技术诊断方法 细胞角蛋白(cytokeratins，CK)是一组细胞骨架蛋白，可在上皮细胞中形成中间丝，并在上皮发育和分化过程中以不同的形式表达。CK19是结膜上皮细胞的标志物，印迹细胞学CK19阳性被认为是角膜上皮结膜化的依据，曾被用于LSCD的诊断，但CK19在角膜缘和外周角膜上皮中也有表达[23]，因此需进一步研究CK19在诊断中的特异性。CK12被认为是角膜上皮细胞的标志物，且可用于评估LSCD的严重程度，CK12阳性提示轻度LSCD，CK12阴性提示重度LSCD[24]。其他标志物(CK7[25]、CK13[24,26]、黏蛋白1[27]和黏蛋白5AC[23,28]等)也可用于LSCD的辅助诊断。

检测CK的传统技术为免疫组织化学染色。然而研究发现，逆转录聚合酶链反应检测黏蛋白5AC转录物较免疫组织化学染色更客观[28]。此外，还有学者应用高效液相色谱法、二维电泳以及液相色谱-串联质谱法对先天性无虹膜患者的泪液进行蛋白质或细胞因子分析[29-30]。与印迹细胞学相比，泪液采集更容易且对上皮损伤较小，但先天性无虹膜患者仅占LSCD病因很小的一部分，因此其诊断价值有限。结膜和角膜上皮细胞特异性标志物以及检测技术的进步提高了传统印迹细胞学的灵敏度和特异度，结合分子生物学和体内成像，LSCD的诊断将更加可靠。

2 LSCD的手术治疗

2.1羊膜移植 羊膜虽不提供干细胞，但能促进残留干细胞的增殖和迁移，有助于角膜的修复、改善视力，减轻疼痛和畏光等症状，对于部分LSCD患者疗效显著。研究表明，将羊膜作为临时补片用于角膜缘干细胞的急性损伤，可减少瘢痕形成和角膜浑浊，降低LSCD进展风险[31-33]。羊膜移植与传统手术结合可提高手术成功率，如联合角膜清创和各种类型的角膜缘上皮移植术等均取得了良好的疗效[34]。

2.2角膜缘上皮干细胞移植

2.2.1自体结膜角膜缘干细胞移植术(conjunctival limbal autograft，CLAU) 由于CLAU取材于自身对侧眼，不存在免疫排斥且移植成功率较高，故目前仍是单侧LSCD的首选术式。有研究显示，CLAU的短期和中期随访手术成功率为80%～100%，且视力提高25%～100%[35]。长期随访显示，术后3年和术后6年的成功率分别为76%和62%[36]。Baradaran-Rafii等[37]回顾分析了34例单侧LSCD患者CLAU术后的病例资料，结果发现，CLAU常见的术后并发症与植片(大小、厚度、位置和排列)及慢性眼表暴露有关。上皮延迟愈合和持续性的上皮缺损是术后最常见的并发症。但关于植片的最佳尺寸尚未达成共识，经典的植片大小为两个60°的植片，目前认为<180°的植片对供眼不会造成影响，过小的植片会影响手术成功率[38]。Baradaran-Rafii等[39]报道了5例采用单一植片取材范围60°的CLAU，结果显示，5例患者均出现持续角膜上皮缺损，其中2例患者出现角膜穿孔。虽然CLAU是比较可靠且成熟的手术方式，但仍有造成对侧眼损伤的风险，因此应重视术前对侧眼的评估及术后并发症的预防。

2.2.2同种异体结膜角膜缘干细胞移植术(conjunctival limbal allograft，CLAL) CLAL取材可来源于健在亲属或死亡供体，植片取材与CLAU相同。CLAL可用于双侧LSCD的治疗，但由于免疫反应和同种异体移植排斥的风险，影响了CLAL的成功率[40]。有研究采用组织相容性抗原供体-受体匹配、全身免疫制剂、术中取材时使用环磷酰胺取结膜缘移植物以及用纤维蛋白胶固定移植物等方法降低了免疫和排斥反应[41-42]，但移植失败也可能与LSCD的病因相关[43]。

2.2.3环形同种异体角膜缘移植术(keratolimbal allograft，KLAL) KLAL主要取材于新鲜尸体，植片由两个半环的板层、小部分巩膜、全角膜缘以及周边透明角膜部分组成，不包括结膜，可提供大量的干细胞用于单侧或双侧LSCD。由于KLAL不提供结膜组织，更适用于先天性无虹膜、接触镜相关以及医源性等LSCD。伴有结膜受损的LSCD可采用改良的新技术，即KLAL联合CLAL[44]。急性免疫排斥反应是KLAL最常见的术后并发症，故KLAL术后患者需要使用全身免疫抑制剂以减轻免疫排斥反应和慢性炎症[45]。

2.2.4离体培养的角膜缘上皮干细胞移植(cultured limbal epithelial transplantation，CLET) CLET取大小为1 mm×2 mm的角膜缘组织进行离体培养后移植到病变角膜上，取材可取自体对侧健眼、活体亲属眼或新鲜尸眼。CLET取材所需的供体细胞数量较少，降低了供眼患LSCD风险，复合移植物培养中缺乏朗格汉斯细胞，可降低免疫排斥反应[40]。CLET的缺点为目前离体细胞的培养主要为组织块培养和细胞悬浮培养，严格的无菌环境和较高的硬件设施使得成本增加，而培养基使用的动物衍生品等增加了人畜共患病的风险，且该方法不能提供结膜组织，有严重结膜疾病的患者不能从中受益[40,46]。近年研究表明，CLET术后总体成功率约为70%，且自体移植物和同种异体移植物的CLET差异无统计学意义[47-48]。已报道的CLET术后并发症包括移植物下出血、感染性角膜炎、疱疹病毒性角膜炎、排斥反应、青光眼、持续性上皮缺损、角膜穿孔以及环孢素相关的不良反应等[40,48-50]。

2.2.5其他来源的黏膜上皮细胞移植 目前对双侧LSCD的治疗仍是一个挑战。为了解决供体组织匮乏的问题，已有研究寻找其他来源的干细胞用于眼表重建，其中体外培养的口腔黏膜上皮移植已被证明是安全、有效的替代品，成功率高达80%[51-52]。体外培养的口腔黏膜上皮移植失败主要与持续的角膜上皮缺损、角膜表面新生血管形成以及角膜表面的纤维化有关[53]。Bardag-Gorce等[54]报道，术后发生角膜表面新生血管生成可能是由于缺乏抗血管生成因子。但目前对于术后新生血管生成的具体机制尚不清楚。此外，人体胚胎干细胞、皮肤表皮干细胞、毛囊干细胞、骨髓间充质干细胞和未成熟牙髓干细胞等其他细胞来源正在研究中[55]，但需要进一步的实验证据证明它们在LSCD中的功效。

2.2.6单纯角膜缘上皮移植术(simple limbal epithelial transplantation，SLET) 2012年，Sangwan等[56]提出应用SLET治疗单侧LSCD，从健康眼睛获得2 mm×2 mm角膜缘组织并分成8～10个小块保存于平衡盐溶液中，然后360°环形剪开球结膜，去除角膜表面的新生血管及结膜上皮，将新鲜羊膜置于角膜上，并通过纤维蛋白胶将移植物均匀地分布在新鲜羊膜上，最后表面覆以绷带镜，该技术需要的角膜缘组织非常少，降低了CLAU供体眼LSCD的风险，成功率较高。Amescua等[57]用冷冻保存的羊膜改进了SLET方法，他们将角膜缘组织置于双层羊膜之间，为干细胞增殖建立胚胎时期的微环境，称之为“夹心技术”，术后移植成功率达100%，且术中及术后随访期间未见明显并发症，视力也均有所提高。Vazirani等[58]的多中心研究显示，自体SLET成功率高达80%，两行视力提高率约为65%。Basu等[59]的单中心研究报道了对125例单侧LSCD患者行自体SLET平均随访1.5年的结果，成功率为76%，两行视力提高率为75%。Arora等[60]的前瞻性研究比较了SLET和CLAU，两者在眼表重建的成功率均为100%，且两者在眼表重建及视力改善方面疗效相当。在已报道的受体眼的并发症中局部LSCD复发最常见，在不影响视轴的情况下可密切观察，必要时行手术干预；其他并发症还包括角膜结膜化进一步进展、睑球粘连、羊膜下出血、植片与羊膜间的不粘连移位、无菌性或细菌性角膜炎、角膜新生血管的复发、持续性角膜上皮缺损以及角膜上皮过度增生等，可行相应的对症处理[50,58- 59,61-62]。虽然大多数报道SLET用于单眼疾病，且主要是自体来源的SLET，不需要免疫抑制剂，但Bhalekar等[63]报道了异体来源的SLET也可治疗双侧LSCD，虽然术后3个月内出现了同种异体移植物排斥反应，但予以局部及全身激素治疗后好转，研究强调了异体来源的SLET需持续使用免疫抑制剂。可见，SLET为角膜盲病例提供了实用的解决方案，特别是在离体扩增技术不实用的地区。

3 小 结

眼部成像技术及分子标志物检测技术的发展使人们对角膜及角膜缘细胞的结构有了进一步的认识，同时提高了对LSCD的精确诊断。建立LSCD发生阈、对LSCD的严重程度进行分层仍处于临床研究中。目前尚未确定角膜缘上皮干细胞的特定分子标志物。近年来，在供体来源相对匮乏的情况下，培养的角膜缘上皮干细胞移植显示了良好的应用前景。但培养后的角膜干细胞的分化、生理生化的变化以及异体移植后如何降低排斥反应等一系列问题均亟待解决。总之，随着培养和扩增技术的发展以及支架和基质的改进，新一代干细胞技术将用于临床以最终解决LSCD的问题。