肿瘤免疫治疗的预测和预后标志物*

付烊，章必成

(1.湖北中医药大学附属襄阳医院肿瘤科，襄阳 441001；2.武汉大学人民医院肿瘤中心，武汉 430060)

恶性肿瘤的治疗已经全面进入精准医学时代。通过寻找生物标志物以判断肿瘤的生物学行为和选择合适的治疗手段，是精准医学的一个重要特点。生物标志物通常被定义为一种可以客观监测和评估正常生理进程、病理进程或对某种治疗干预药物应答情况的指标或标志。近年来，各种生物标志物已经开始用于肿瘤免疫治疗的预后判断和疗效预测，并收到良好效果。

1 肿瘤预测和预后标志物的概念

肿瘤的预测标志物通常用于预测特定人群对某种特定手段的疗效，可以成为治疗的靶点。例如，对晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者进行基因检测，如果发现表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)或Braf等驱动基因敏感突变阳性，则可分别给予相应的靶向药物进行治疗[1]。肿瘤的预后标志物则可用于判断患者的复发风险和生存时间，与患者接受何种治疗方法无关。例如，对乳腺癌患者进行21或58基因分析，以判断患者的整体预后。

定义肿瘤的预测和预后生物标志物，通常需要通过临床试验进行严格挑选[2]。迄今为止，临床常用的肿瘤预测生物标志物包括：乳腺癌(HER-2、ER/PR)，结直肠癌(K-ras)，胃肠道间质瘤(c-Kit)，胃癌(HER-2)，NSCLC(EGFR、ALK和Braf等)，以及黑色素瘤(Braf)等；美国食品药品管理局(FDA)批准的肿瘤预后生物标志物包括：乳腺癌(58基因RNA表达谱、70基因表达谱、HER-2和TOP2A)，前列腺癌(tPSA)等。

随着恶性肿瘤的治疗全面进入免疫治疗时代，免疫治疗的生物标志物逐步成为当前研究的热点。目前，肿瘤免疫治疗的生物标志物包括四大类：①来自肿瘤新抗原，如肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)、微卫星高度不稳定性(microsatellite instability-high，MSI-H)/错配修复缺陷缺失(mismatch repair deficient，dMMR)和新抗原负荷等；②来自肿瘤炎性微环境，如程序性细胞死亡蛋白配体1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphoeytes，TILs)和部分炎症标志物等；③与肿瘤免疫抑制/逃逸有关的细胞或分子，如调节性T细胞(regulatory cells，Tregs)、骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、吲哚胺2，3-二氧化酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)、T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM-3)和淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)等；④来自宿主环境的标志，如肠道菌群、胚系基因特征等[3]。在这些标志物中，大部分可用于鉴别有效、无效甚至有害人群，即为预测标志物；少数兼有预测疗效和判断预后的作用，即同时为预测和预后标志物。

2 免疫治疗正性疗效预测的生物标志物

2.1PD-L1 在肿瘤及其微环境中，PD-L1分为组成型表达和诱导型表达。目前认为，组成型表达是PD-L1基因在肿瘤组织中的固有表达，与免疫治疗疗效预测关系不大；而诱导型表达是指PD-L1在干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等分子的作用下出现的适应性聚焦表达，可导致肿瘤局部出现抑制性炎症微环境，这也恰恰为肿瘤免疫治疗提供了靶点[4]。

已经证实，PD-L1表达有如下特征：①呈连续性表达模式，即肿瘤中可能有0%～100%的细胞表达PD-L1；②表达可能随着治疗(免疫、化疗、放疗或抗血管生成治疗等)发生改变；③不同瘤种、不同组织学类型的肿瘤以及同一肿瘤内部不同区域的PD-L1表达不同。目前已有多项临床试验和荟萃分析认为PD-L1可以作为预测晚期NSCLC免疫治疗疗效(包括单药免疫治疗及免疫联合化疗等)的生物标志物[5]。由于证据确凿，自2019年起，PD-L1检测得到了NCCN和CSCO晚期NSCLC诊疗指南的一致推荐。然而迄今为止，上述指南并没有明确对肿瘤组织采用免疫组化法检测PD-L1表达时采用何种方法和平台。

虽然PD-L1是目前临床上已被广泛接受的免疫治疗正性疗效预测的生物标志物，然而，它是不完美的疗效预测生物标志物[6]。首先，并非所有的PD-1或PD-L1抑制剂在使用前都需要检测PD-L1。2019年8月，国家药品监督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)批准DAKO公司生产的PD-L1检测试剂盒(克隆号：22C3)在中国上市，用于辅助鉴别可使用帕博利珠单抗(pembrolizumab)治疗的NSCLC患者。2019年12月，NMPA批准DAKO公司的另一款PD-L1检测试剂盒(克隆号：28-8)上市，用于辅助鉴别使用纳武利尤单抗(nivolumab)治疗的非鳞状NSCLC患者。但是，22C3抗体适用于伴随诊断，而28-8抗体仅适用于补充诊断。第二，并非所有PD-L1阳性患者都对免疫治疗有效。以晚期NSCLC为例，PD-L1阳性患者采用pembrolizumab进行一线或二线单药治疗的客观缓解率(objective response rate，ORR)<50%，PD-L1 阴性患者也有10%～20%的ORR。第三，PD-L1表达的检测平台不一致。Blueprint II研究对多种检测平台的一致性进行了对比，发现22C3、28-8和SP263抗体的一致性高，而SP142和73-10抗体的一致性较差。虽然这5种检测试剂盒/抗体均在美国获批上市，但唯有DAKO 22C3 被FDA批准作为伴随诊断的PD-L1检测试剂(其他为补充诊断)。第四，PD-L1的表达具有时空异质性。有研究比较了晚期NSCLC不同时间点、不同转移器官组织中PD-L1的表达情况，发现不仅表达水平相差巨大，而且直接影响了患者接受免疫治疗的无进展生存期(progression-free survival，PFS)。第五，PD-L1表达的检测细胞有待进一步明确。大部分抗体只要求检测肿瘤细胞，但是PD-L1抑制剂阿特珠单抗(atezolizumab)却要求同时检测免疫细胞和肿瘤细胞。

2.2TMB TMB是指肿瘤基因组去除胚系突变后的非同义突变的体细胞突变数量。新抗原是肿瘤特异性突变产生的多肽表位(抗原决定基)，具有结合主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子并被呈递的功能。免疫原性是指由体细胞突变产生“非己”成分(转化为多肽表位)能够被T细胞识别引起肿瘤清除的免疫反应特性。目前认为，肿瘤TMB越高，新抗原产生就越多，肿瘤免疫原性就越高，因此，T细胞抗肿瘤反应越强[7]。

大量研究以及Meta分析已经表明，TMB与PD-1/PD-L1抑制剂在多个瘤种中的疗效相关[8-10]。CheckMate 026研究的探索性分析显示，TMB与单药nivolumab一线治疗晚期NSCLC的PFS呈正相关。CheckMate 227研究第一部分的结果显示：TMB≥10 mut/Mb的NSCLC患者，无论PD-L1表达如何，nivolumab+伊匹单抗(ipilimumab)的PFS均优于化疗。BF1RST研究的中期结果显示，高液态TMB(b-TMB)亚组(≥16 mut/Mb)，atezolizumab疗效有优于化疗的趋势。Mystic研究的探索性终点显示，高b-TMB亚组(≥2016 mut/Mb)，德瓦鲁单抗(durvalumab)和durvalumab+替西木单抗(tremelimumab)疗效均有优于化疗的趋势。基于上述研究结果，NCCN指南认为TMB是新兴的疗效预测生物标志物，TMB检测也已经写入CSCO指南。

然而，TMB也是不完美的疗效预测生物标志物。第一，TMB并非总是与免疫检查点抑制剂治疗的应答相关，其原因是肿瘤以逐步进化的方式发展，从而创造了克隆层级；克隆性突变(或同质性肿瘤)产生的新抗原可能比来自亚克隆突变(或异质性肿瘤)的新抗原更能有效引起肿瘤免疫应答[11]。第二，b-TMB并不能取代组织TMB，两者是互相补充的关系。如果等位基因突变为低丰度的有意义的突变，b-TMB可能检测不到，这样可能出现b-TMB少于组织TMB的情况；另一方面，由于肿瘤组织空间的异质性以及克隆分支等原因，b-TMB检测出的亚克隆计数会多于组织TMB，但却不一定有意义[4]。第三，TMB与PD-L1表达通常呈不/弱相关。已有多项研究证实，高TMB和PD-L1高表达人群只有非常少的交叉。第四，关于TMB的检测技术、平台、截断值等均不得而知[12]。二代测序技术(next generation sequencing，NGS)检测TMB分析非常费时，价格昂贵，技术要求高，提供的数据复杂；TMB阈值尚无明确定义。第五，TMB与免疫联合化疗的疗效关系不明。来自KEYNOTE-021、189和407研究的结果显示，无论组织学类型，还是通过全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)评估的TMB与pembrolizumab+含铂化疗或单用含铂化疗的疗效之间均无显著相关性。

2.3MSI-H/dMMR MMR系统是生物进化的“保卫者”，具有修复DNA碱基错配的功能，可以维持基因组的稳定性和降低自发性突变。人类的MMR系统含有9个错配修复基因MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、MLH1、MLH3、PMS1及PMS2等，其中以MLH1和MSH2功能最为重要，负责最主要的修复任务。MSI-H常由dMMR引起[13]。多项临床研究表明，MSI-H/dMMR实体瘤可从免疫治疗中显著获益[12]。基于5个临床试验共149例患者ORR为 39.6%的结果，2018年5月23日，FDA宣布加速批准pembrolizumab用于对具有特定遗传(生物标志物)特征的癌症患者的治疗。这是FDA首次不依照肿瘤的组织来源，而是基于生物标志物批准的抗肿瘤疗法[14]。

MSI是遗传不稳定性的标志物，因此，伴有不稳定基因组的肿瘤可同时表现为MSI-H和高TMB[15]。大多数(83%)MSI-H的样本同时表现为高TMB，然而，仅16%高TMB样本表现为MSI-H。这两种表型同时出现与肿瘤类型高度相关，如高TMB和MSI-H同时出现在胃肠道肿瘤中，但是在伴高TMB的黑色素瘤、肺癌和鳞状细胞癌中，MSI-H并不常见。因此，MSI-H与TMB是部分重叠的疗效预测生物标志物。

2.4其他新兴的疗效预测标志物 除上述3个已被临床公认的正性疗效预测生物标志物之外，人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-I分子的多样性及特定T细胞亚群T细胞受体(T cell receptor，TCR)的克隆性等也是新兴的、值得关注的标志物。HLA基因能够“教”免疫系统中的T细胞识别“自己”和“异己”，拥有更多样化HLA基因意味着免疫系统更有能力识别不属于机体内部的“东西”；已有研究表明，HLA-I类分子多样性越高，免疫治疗疗效越好；如果合并突变负荷高，免疫治疗疗效就最好[16]。

机体内所有的TCR构成了TCR库，其多样性直接反映了机体免疫应答的状态。TCR库的瘤内异质性可能和基因组的瘤内异质性密切相关，与患者术后的复发风险成正相关。最新研究表明，CD+8PD-L1+T细胞TCR克隆多样性更高，免疫治疗响应越好[17]。

3 免疫治疗负性疗效预测的生物标志物

3.1STK11基因突变 STK11基因又名LKB1基因，其突变能调节冷肿瘤免疫微环境，是非鳞NSCLC PD-1抑制剂原发耐药的重要因素。已有研究证明，无论pembrolizumab还是durvalumab治疗晚期NSCLC，STK11突变或KEAP1突变均与免疫治疗疗效呈负相关。而且，TMB和PD-L1的肿瘤细胞阳性比例分数(tumor proportion score，TPS)状态未影响到STK11突变或KEAP1突变NSCLC患者接受免疫治疗的结果[18]。

3.2PTEN基因缺失 PTEN基因缺失可导致PI3K通路增强，进而致IFN-γ、颗粒酶B基因表达降低以及CD+8T细胞数目减少。在晚期黑色素瘤中，PTEN缺失与TILs减少正相关，PTEN表达与抗PD-1治疗反应相关[19]。在子宫平滑肌肉瘤中，PTEN缺失导致新抗原减少，进而导致免疫治疗耐药[20]。

3.3转化生长因子-β(TGF-β)上调 TGF-β是一种重要的免疫抑制分子，主要通过刺激组织纤维化和细胞外基质沉积，抑制免疫功能，促进血管生成和上皮间质转化。2018年，《Nature》同期发表两篇文章[21-22]，分别从基础及临床两方面揭示肿瘤相关成纤维细胞分泌的TGF-β通过清除T细胞介导PD-L1抑制剂耐药，与atezolizumab的疗效负相关。

3.4β-catenin信号通路激活 一方面，β-catenin通过促进ATF3 的转录，抑制T细胞浸入肿瘤局部。另一方面，Wnt/β-catenin通路激活，提升Tregs存活能力，诱导CD+4T细胞向Th17分化，促使树突状细胞分泌IL-10/12，抑制CD+8T细胞功能，从而抑制机体抗肿瘤免疫应答。

3.5JAK突变 由肿瘤特异的T细胞产生的IFN-γ，能识别肿瘤细胞或抗原呈递细胞上的相应受体，从而发挥免疫效应。肿瘤细胞上IFN-γ通路相关蛋白，如IFN-γ受体(IFNGR1与IFNGR2)、IFN-γ受体链(JAK1与JAK2)、STATs及IRF1等突变与缺失，下游免疫反应无法启用(MHC-I与PD-L1)，导致免疫治疗耐药[23]。

3.6HLA-I表达缺失 B2M参与HLA-I类分子折叠和转运到细胞膜。对基线和免疫治疗复发后的样本进行NGS检测，发现B2M突变。B2M突变能使肿瘤细胞膜表面的HLA-I表达缺失，无法实现抗原呈递，CD+8T细胞从而失去识别功能[24]。

3.7HLA-I等位基因的杂合性缺失 HLA-I等位基因杂合性缺失即HLA-I纯合型。临床研究表明，至少一个位点HLA-I(A&B&C)纯合型及突变负荷低的患者，免疫治疗不获益[25]。

4 肿瘤免疫治疗的预测和预后生物标志物

根据预后生物标志物的定义，并不存在免疫治疗的预后标志物一说。前文提到的PD-L1、TMB，都不是肿瘤的预后生物标志物。最新研究表明，PD-L1表达越高，靶向治疗耐药出现越早，PD-L1高表达是靶向用药的负性预测指标；当淋巴细胞浸润被用作NSCLC的预后标志物时，细胞增殖、PD-L1、吸烟史和组织学应该予以考虑[26]。虽然CheckMate 227研究提示TMB虽然同时具有预测和预后价值，但CheckMate 026认为高TMB患者化疗效果更差；迄今为止，仍认为TMB只有预测免疫治疗疗效的价值[27]。

T细胞炎症微环境是恶性肿瘤的正向预后标志物[28]，目前有研究认为它还是免疫治疗的疗效预测标志物。炎性基因表达谱(gene expression profiling，GEP)是检测特定细胞或微环境中基因RNA水平表达，可反映细胞功能或评估微环境状况；炎性GEP可反映肿瘤微环境中免疫细胞状况，包含了细胞类型、数量、功能、定位等信息。一项涉及20个瘤种的313例患者的回顾性研究，分析了PD-1抑制剂疗效和18个炎症基因表达水平的相关性，发现GEP评分高的患者亚组，ORR更高，PFS更长[29]。虽然TMB与GEP可以独立预测疗效，但是将两者联合起来，预测效果会更好。对KEYNOTE系列研究汇总显示，在泛实体瘤、头颈部鳞癌和NSCLC等3个队列中，ORR和PFS获益患者均为：TMBhiGEPhi>TMBlo或GEPlo>TMBloGEPlo [30]。

体细胞拷贝数变异(somatic copy number alterations，SCNA)包括非整倍体、亚二倍体、超二倍体、四倍体等，是恶性肿瘤的负性预后标志物。最新研究表明，它是免疫治疗疗效的正向预测标志物。在多种肿瘤中，全染色体SCNA与免疫浸润呈负相关；在ipilimumab治疗黑色素瘤时，SCNA与TMB可以一起用于预测疗效，胜过其中任一指标；而且，SCNA可以独立用于预测疗效。其机制可能是SCNA导致免疫活性相关基因缺失，如HLA基因。

5 结束语

目前关于免疫治疗疗效预测的标志物研究主要集中在预测正向疗效的PD-L1、TMB和MSI-H/dMMR上，其中又以PD-L1在临床应用上的认可度最高。HLA-I分子的多样性、TCR库的克隆性和T细胞炎性GEP有望成为新兴的正性疗效预测标志物。免疫治疗负性疗效预测的生物标志物则主要包括特定基因的突变、免疫抑制分子或免疫抑制细胞等，但这方面的研究还刚刚起步，尚不能成为临床应用的证据。现有的研究表明，仅有T细胞炎性GEP和SCNA，既是肿瘤的预后生物标志物，也是免疫治疗的疗效预测标志物。寻找和发现最佳的肿瘤免疫治疗的预测和预后标志物，依然道阻且长。