现代微生物分类鉴定技术在绿色环保化白酒酿造中的应用

隋 明,谢慧蓉,周 文,唐贤华

(1.四川工商职业技术学院 酒类与食品工程系,四川 都江堰 611830;2.四川大学 轻纺与食品学院,四川 成都 610065)

白酒是经过不同种属微生物长时间发酵、陈酿分离形成的澄清透明的含乙醇产品。随着科学和现代生物工程技术的发展,微生物技术已广泛应用于白酒酿造。社会的不断发展和人类健康意识的不断增强,要求白酒酿造业实现绿色环保化,即生态酿酒,以实现经济效益与生态效益的有效统一。这要求酿酒业应用现代微生物分类鉴定技术,尤其是对以PCR[1]和DNA[2]为主的微生物进行分类鉴定的技术,以确定白酒酿造不同阶段的优势菌群。

1 白酒的微生物分类鉴定技术概述

白酒作为一种常见且传统的发酵产品,对发酵窖池的要求较高。白酒发酵时窖池中的微生物及其形成情况对酒体风格有重要影响[3]。五粮液、泸州老窖等大型白酒企业都在窖池中培养微生物生存环境,以便微生物在窖池中发酵形成新的能量[4]。现代生物工程技术的研发为微生物的分类鉴定带来了发展空间。在传统微生物分类鉴定技术的基础上[5],借鉴微生物代谢组学[6]和PCR、DGGE等微生物分析技术[7],可以为酿酒产业创建更好、更具体、更深刻的现代微生物分类鉴定技术,以弥补传统微生物分类鉴定技术的不足。现代微生物分类鉴定技术能在酿酒发酵中实现微生物技术与其代谢规律的有效结合。

2 微生物分类鉴定技术在绿色环保化白酒酿造中的应用

绿色环保化白酒酿造即生态酿酒由沱牌集团的工程师提出。生态酿酒主要是指建立科学合理的微生物培养环境,用安全、高质量的方式实现酿酒行业经济效益和社会效益的最大化;在整个白酒酿造过程中实现人与自然的和谐相处；对现有的酿酒资源给予低能耗处理,将绿色发展理念融入每一个生产环节,让微生物的繁殖和生长建立在可持续发展的基础之上。

2.1 传统微生物分类鉴定技术

在新技术产生之前,白酒酿造过程中微生物的分类鉴定一般采取直接的方式,主要分为五个步骤。第一步是微生物样品采集,包括酒曲、酒醪和制作过程中接触的空气微生物和水。第二步是对采集到的微生物进行计数,方法有三种[8]:一是通过显微镜观察,这种方法要求先对样品进行稀释,且只能记录微生物菌落的数量,无法对微生物的性质做出区分;二是活菌计数法,这种方法能显示活菌的数量,但无法对死菌或休眠的菌体进行计算；三是最大可能计数法,通常用于测定具有特殊功能的菌群。第三步是酿酒微生物的培养和繁殖,目的是扩大活菌数量,增加酿酒过程中的菌落。第四步是微生物分离,采用的是梯度稀释法,即对采集的微生物进行平板画线,有效分离菌落。第五步是微生物鉴定,需要生化实验辅助完成,即按相关说明和规范,对采集分离的微生物进行鉴定实验,并检验实验结果,确定微生物菌株。

2.2 基于PCR 的DNA指纹图谱分类鉴定技术

近年来生物分类鉴定技术得到良好发展,PCR技术在酿酒业中被广泛应用。用这种方式对微生物进行分类鉴定,不但快速、便捷、能耗低,而且可以验证原料是否是转基因产品[9]。使用数学模型如聚类分析法等对用气质联用、液相色谱测定的白酒风味数据进行归类,能得到白酒样品的风味特征,这种方法被称为指纹图谱法。展学孔等采用指纹图谱法测定小曲白酒的风味强度特征等,发现原料的品种和产地对白酒品质有较大影响[10]。

2.2.1 PCR-DGGE 克隆分析技术

PCR-DGGE 克隆分析技术也叫变性梯度凝胶电泳技术,是聚合酶链式反应的后续变形方法。聚合酶链式反应的具体应用是对微生物体内存在特异性目的的片段进行扩张,使其改变原有的形态。使用变性梯度凝胶电泳技术，在聚丙烯酰胺凝胶中添加尿素和变性剂,同时控制凝胶比例,能使微生物的DNA排列发生梯度变化。在外部电压相同的条件下,DNA的解链速度会发生改变,相应的电泳迁移率也会变化,可以从电泳上分离出需要的DNA片段,并用PCR-DGGE 克隆分析技术对其进行处理,以完成对微生物的分类鉴定。目前有学者将该项技术用于白酒酿造,如胡晓龙使用该项技术考察了浓香型白酒窖泥中梭菌的群落结构与窖泥质量之间的关系[11];江汶钰等使用PCR-DGGE技术研究了豉香型白酒中的细菌群落[12]。

2.2.2 SSCP 技术

SSCP技术[13]建立在DNA特性基础上,结合PCR-DGGE 克隆分析技术对微生物进行分类鉴定。这种方法更需要注意细节控制,主要目的是分析微生物的遗传学特征。微生物菌落中有不同的基因序列,且序列长而完整,能够提供丰富的分类信息。SSCP技术在酿酒过程中经常被用于鉴定霉菌分子微生物。

2.2.3 末端限制性片段长度分析技术

末端限制性片段长度分析技术是专门用于鉴定不同微生物群落的方法,也是一种指纹技术。微生物群落呈现的多样性能被敏锐地检测。将微生物设计成一对合适的引物,并做好明显标记,经过PCR克隆扩展,加上酶切后特定的生长顺序,将检测到的标记与DNA片段进行对比,了解微生物群落的差异性,鉴定微生物群落的属性。

2.2.4 扩增片段长度多态性分子标记技术

扩增片段长度多态性分子标记技术需要末端限制性片段长度分析技术做载体,并从中选择聚合酶链式反应,将可以利用的酶作为研究对象进行基因顺序的排列组合,培养不同的酶切片段。培养出的酶切片段可以用来和有共同黏性末段的人工接头连接,形成技术模板,在其中加入引物,用克隆分析技术进行扩展,只有配对的微生物酶切片段才能被扩展。

2.3 磷脂脂肪酸法

磷脂脂肪酸法是从20世纪开始用于白酒研究的,用于帮助确定微生物定量问题，具有高效、快速等优点。不同种类的微生物菌类群落可以用不同的磷脂脂肪酸法进行研究。可以借助图谱对微生物进行定量研究,标记设置的微生物群,确定群中微生物的性质和数量。磷脂脂肪酸法还可以用于鉴别活体的微生物群落。通常,我们认为微生物体内的细胞数量是一定的,在对微生物的种类进行鉴别时,这种方法具有辅助作用。曹宇等使用磷脂脂肪酸法研究了芝麻香型大曲中微生物群落的真菌、细菌含量及数量上的变化情况[14]。

2.4 Biolog微平板

Biolog 微平板是美国在20 世纪研发的一种技术,最初只能用于对纯种的微生物进行分类鉴定,经过发展,现已能鉴定两千多种菌类。Biolog 微平板能准确估计酿酒时微生物的生物群落代谢问题，具有灵活、分辨率高等优点。Biolog 微平板具有自动化和标准化的检验方式,能提升微生物分类鉴定效率。唐小丽等利用该技术分析芝麻香型白酒高温大曲的微生物群落,发现发酵过程中的曲样可以根据发酵时间分为四类[15]。

2.5 RNA/rDNA 序列分析

16SrRNA/rDNA 序列分析是现在标准的微生物鉴定方法,是通过对微生物的鉴定、扩展、测序相关记录进行分析,按照国际标准将测序结果分成多个组合单元,最后将合成的数据提交到数据库进行检索,查询相似度最高的序列,并设置发育树,对微生物进行良好定位,便于查询对比。18SrRNA/rDNA 序列分析主要用于奠定微生物群落在系统中的发育地位,因为无论是16SrDNA还是18SrDNA,都不会轻易受环境影响而改变自己的性质,因此，通过比较两者的同源性可以确定它们在发育过程中的不同。

3 结语

白酒的酿造离不开微生物的作用。使用不同微生物分类鉴定技术既能发现微生物在酿造不同香型、不同窖龄白酒中的作用,也可以减少白酒酿造和检测过程中的环境污染和原料浪费,更好地实现白酒绿色低碳产业化发展。在发展生态酿酒的过程中,可以通过微生物技术了解不同微生物的层次、性质和数量,掌握微生物的发展规律,尤其是曲子、窖泥中微生物群落演替的变化规律,为白酒口味的酿造奠定良好的基础。