FoxO1在1，25（OH）2D3调控高糖环境下成骨细胞代谢中的作用

周佳琦， 舒林径， 熊毅， 张艺馨， 向琳， 伍颖颖

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心，四川 成都（610041）； 2.重庆医科大学附属口腔医院种植科，重庆（400016）； 3.口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院种植科，四川 成都（610041）

糖尿病发病率居高不下且逐年上升，中国的成人群体中，估计糖尿病总患病率为10.9%，而前驱糖尿病患病率达35.7%［1-2］。越来越多的患者面临着由此带来的骨量减少、骨质疏松、感染等并发症的困扰，其主要通过血糖升高导致相应的病理变化［3］。研究证实高糖血症导致钙伴随着糖尿流失，并干扰了维生素D 的代谢而导致钙吸收障碍；另一方面，高血糖可刺激单核细胞分泌TNF-α 和IL-6 等炎症因子，增加骨吸收［4］；同时，高糖环境会直接抑制成骨细胞的功能，并加重破骨细胞引起的骨吸收，从而减少新骨生成，影响骨的愈合，导致骨组织微结构的破坏［5］。由此，众多学者认为正是高糖血症影响了糖尿病患者的骨代谢［6］。颌骨亦可出现骨代谢异常［7］，如发生牙槽骨丧失及牙周病变，甚至导致牙列缺损或牙列缺失。大量研究证实，糖尿病会延缓种植体周的骨改建过程，干扰种植体周围骨结合，甚至导致种植体松动失败［8］。因而，糖尿病曾是人工牙种植的相对禁忌证。如何改善糖尿病患者的骨代谢受到了学术界的广泛关注。1，25 二羟基维生素D3（1 alpha，25-dihydroxy-cholecalcifero，1，25（OH）2D3）是维生素D（vitamin D，Vit D）的生物活性形式，由类固醇受体家族中的维生素D 受体（vitamin D receptor，VDR）介导［9］，调控全身钙和磷酸盐的水平，促进成骨和维持人体内骨量［10］。Vit D 可双向调节骨的合成和分解，在骨吸收和骨重塑之间的动态平衡过程中起到重要作用［11］。越来越多研究提出，适当补充Vit D 能够促进牙周骨组织的矿化，抑制牙槽骨的吸收。近几年的研究发现Vit D 除了其传统的成骨调节作用外，还与心血管疾病、肥胖和糖尿病等疾病的发生有关。动物体内实验和临床观察均证实，Vit D 与糖尿病发生之间关系密切。本课题组前期研究结果证实，单纯胰岛素治疗，能一定程度上改善糖尿病大鼠种植体周骨组织形成和矿化，但其水平仍较正常状态低。而联合使用1，25（OH）2D3可以增强胰岛素的作用效果，使糖尿病大鼠的种植体稳定性和种植体-骨结合率增加，接近正常[12]。叉头转录因子-1（forkhead transcription factor 1，FoxO1）是叉头转录因子家族中最先被发现且被广为研究的成员，在糖尿病及其并发症的发生发展过程中发挥着重要作用。随着对骨组织的深入研究，发现除了β 细胞和肝细胞之外，骨组织对葡萄糖的代谢也起着调控作用。本实验拟通过观测1，25（OH）2D3作用于高糖环境下成骨细胞功能、成骨细胞中FoxO1 的表达变化，初步探究糖尿病的典型特征——高糖血症影响骨代谢的可能途径和1，25（OH）2D3对其潜在的治疗机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料

倒置荧光相差显微镜（Olympus 公司，日本）；ABI7300 实时荧光定量基因扩增仪（Ambion 公司，美国）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；MC3T3-E1 成骨细胞系（ATCC，美国）；1，25（OH）2D3（Sigma 公司，美国）；低糖DMEM 培养基（5.5 mmol/L）、高糖DMEM 培养基（22 mmol/L）（Hyclone 公司，美国）；胰蛋白酶（Gibco 公司，美国）；胎牛血清（Gibco 公司，美国）；FoxO1 一抗（Santa Cruz 公司，美国）；免疫荧光二抗（Life Technologies 公司，美国）；茜素红（Sigma 公司，美国）；CCK-8 试剂盒（Dojindo 公司，日本）；Annexin V，FITC 凋亡检测试剂盒（同仁公司，日本）；逆转录试剂盒（Thermo 公司，美国）。

1.2 细胞系及分组

本研究细胞选用MC3T3-E1 成骨细胞系。复苏细胞，用含10%FBS，1%双抗低糖DMEM 的培养基，于37 ℃下5%CO2孵箱培养。

共设置3 组，对照组：低糖（5.5 mmol/L）DMEM培养基培养；高糖组：高糖（22 mmol/L）DMEM 培养基培养；高糖+1，25（OH）2D3组：高糖DMEM+1，25（OH）2D3培养基培养。

1.3 细胞增殖实验

取对数生长期的成骨细胞，用低糖DMEM（5.5 mmol/L）配制成1 × 105个/mL 的细胞悬液，接种于96 孔板中，静置培养4 h，直至大部分成骨细胞贴壁后，按分组分别更换相应培养基，每组设3 个复孔。在37 ℃培养24 h、48 h、72 h后，吸弃培养液，加入CCK-8 与基础培养基的混合液。标记空白孔，在其中滴入同样的混合液作为空白对照。置于培养箱孵育中4 h 后取出。酶标仪检测450 nm 处吸光度。按如下公式计算细胞增殖活力：细胞增殖活力＝（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）。

1.4 细胞凋亡检测

取对数生长期的成骨细胞，配置1 × 106个/mL的细胞悬液，滴加于6 孔板中，分组培养48 h。收集上清部分，用PBS 洗细胞2 次，收集洗涤液。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，加入2% BPS 防止消化过度。将消化后的悬液转移至离心管中，加入收集的上清液和洗涤液，1 000 rpm 离心3 min，弃掉上清部分，重复2 次。加入1 × Annexin V Binding Solution，制备细胞悬液，加入Annexin V/FITC 结合物、PI Solution，室温下避光培养15 min，加入1×Annexin V Binding Solution。细胞筛网过滤，加样到流式细胞仪检测。

1.5 细胞分化检测

取培养至第三代的成骨细胞以1 × 105个/mL的密度接种于24 孔板中，24 h 后更换终浓度为含10 mmol/L 的β-甘油磷酸钠与50 μmol/L 抗坏血酸的诱导培养基进行分组培养，每隔2～3 d 换液1次。培养19 d 后在显微镜下观察，发现细胞聚集成不透明区域，呈结节样时，即可用PBS 漂洗两次，再用无水乙醇固定10 min，0.1%茜素红染色，置于37 ℃孵箱中作用30 min。去除非特异结合后，10%氯化十六烷基吡啶共孵育15 min 脱色，在562 nm 处测量吸光度。

1.6 检测FoxO1蛋白表达及其与细胞核的位置关系

取对数生长期的成骨细胞，配置1 × 105个/mL的细胞悬液，接种于24 孔板中，分组培养1 d 后取出。 PBS 洗涤5 min × 3 次，经4%多聚甲醛固定后，加入0.25%Triton 室温放置10 min，PBS 洗涤5 min × 3 次；加入4%BSA 封闭30 min，PBS 洗涤2次；加入FoxO1 一抗，湿盒中37 ℃孵育60 min 后，4 ℃过夜；PBS 洗涤5 min × 3 次，吸干孔板内液体，滴加PBS 1∶100 稀释的生物素化二抗，湿盒37 ℃孵育60 min，弃干净液体，PBS 洗涤5 min × 3 次。DAPI 1∶1 000 染色5 min，放置于荧光显微镜下采集图像。每组两个复孔，200 倍视野下，分别选取左侧上、左侧下、右侧上、右侧下、正中5 个视野进行图像采集。利用image-pro plus 进行细胞计数。

1.7 检测FoxO1 的mRNA 表达

Trizol 法提取总RNA，用逆转录试剂盒逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），参照试剂说明书上机进行qRT-PCR 检测。根据Genebank提供的基因序列设计引物，FoxO1 基因设计内参GAPDH，得出每组的Ct 值，采用2-△△Ct 表示实验组目的基因的表达量/对照组基因表达量的倍数。引物序列见表1。

表1 基因名称以及qRT-PCR 的引物序列Table 1 Names of genes and primer sequences for qRT-PCR

1.8 统计学分析

以均数±标准差表示所得数据，采用SPSS13.0软件包统计分析数据结果。采用单因素方差分析及LSD 法处理所得数据，检验水准为α＝0.05。

2 结 果

2.1 1，25（OH）2D3抑制高糖引起的细胞异常增殖

采用CCK-8 试剂盒分析高糖环境和高糖+1，25（OH）2D3对成骨细胞增殖能力的影响。检测结果表明，高糖环境可促进细胞的增殖，而1，25（OH）2D3能够逆转高糖对细胞增殖的促进作用，培养48 h 后各组细胞增殖能力出现显著差异（F＝22.589，P＝0.002），72 h 后组间差异亦具有统计学意义（F＝21.401，P＝0.002）。培养48 h 和72 h 后，高糖组成骨细胞增殖活力均强于对照组（P＜0.05）；高糖环境加入1，25（OH）2D3后，细胞增殖受到抑制，48 h 和72 h 时均低于高糖组，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图1）。

Figure 1 Proliferation of osteoblasts图1 成骨细胞增殖能力检测

2.2 1，25（OH）2D3 减少高糖环境下成骨细胞的凋亡

通过Annexin V/PI 双染，测定细胞的凋亡情况。结果表明高糖环境下，细胞凋亡明显增加（尤其是凋亡早期细胞），在加入1，25（OH）2D3后，细胞凋亡有所减少（图2）。

Figure 2 Flow cytometry analysis of apoptosis图2 细胞凋亡检测结果（Annexin/PI 双染）

2.3 1，25（OH）2D3逆转高糖引起的成骨分化抑制

分组培养19 d 后，通过钙结节测定细胞分化情况。倒置相差显微镜下观察，可见贴壁生长的成骨细胞形成网状结构，生长密集，局部细胞聚集成团，形成多个大小不等，圆形的矿化结节。茜素红染色时见矿化结节呈红染，不透明状，有的矿化结节之间相互融合，如图3a。高糖组钙结节大小、面积显著减少，而加入1，25（OH）2D3后，成骨细胞能够分泌更多的矿化基质，钙结节形成明显增加。茜素红半定量结果显示（图3b），3 组矿化基质的差异具有统计学意义（F＝22.175，P＝0.002）。高糖环境下成骨细胞内矿化基质减少（P＜0.01）；1，25（OH）2D3能够逆转这种趋势，提高矿化物含量（P＜0.01），但仍略低于对照组（P＜0.05）。

2.4 1，25（OH）2D3促进FoxO1 核外转移

对照组细胞平均74.6 个/视野，高糖组平均110.4 个/视野，高糖+1，25（OH）2D3组平均57.4 个/视野。细胞数目高糖+1，25（OH）2D3组＜对照组＜高糖组，与CCK-8 结果趋势一致。

免疫荧光染色观察FoxO1 分布（图4a）：低糖环境下，细胞核内外均可见绿色荧光，部分细胞可见细胞核的周围具有高亮荧光条带，显示FoxO1 细胞核外表达量较细胞核内多。在高糖环境下，细胞核外高亮荧光带消失，FoxO1 细胞核内外表达量相近。加入1，25（OH）2D3组后，细胞核内FoxO1 的绿色荧光显著减弱，细胞核外呈现强绿色荧光带，显示FoxO1 主要分布于细胞核外。

对每组的5 个视野进行计数，各组细胞核内表达FoxO1 的细胞比例具有统计学差异（F＝170.921，P＜0.001）（图4b），高糖组细胞核内表达FoxO1 的细胞比例显著高于其他两组（P＜0.01）。

2.5 1，25（OH）2D3减少FoxO1 mRNA 表达培养72 h 后，各组FoxO1 mRNA 表达水平不完全 相同（F＝11.669，P＝0.009）。高 糖组FoxO1 mRNA 表达水平显著高于对照组和高糖+1，25（OH）2D3组（P＝0.006），而对照组和高糖+1，25（OH）2D3组之间无明显差异（图5）。

3 讨 论

高糖环境可显著影响细胞活性氧的功能，增加成骨细胞内氧化应激水平［13］，从而导致成骨细胞内异常增殖增加（P＜0.05）。FoxO1 是成骨细胞氧化还原平衡的主要调控因子，当高糖诱发氧化应激增加时可刺激FoxO1 分泌［14］。本研究发现，高糖环境下FoxO1 基因表达增加，蛋白向细胞核内转移，FoxO1 转录活性增加。Wnt/β-catenin 通路参与骨代谢的调控，激活后能够促进成骨分化、抑制成骨细胞凋亡。同时，β-catenin 也是FoxO1 的转录激活因子。在氧化应激状态下，FoxO1 与Wnt 通路竞争性结合β-catenin［15］，从而抑制Wnt 信号，导致成骨分化受到抑制、凋亡增加。

Figure 3 Mineralized nodule formation of osteoblasts by alizarin red staining图3 成骨细胞形成矿化结节茜素红染色结果

Figure 4 The distribution of FoxO1 protein in osteoblasts shown by immunofluorescence staining图4 FoxO1 蛋白在细胞内的分布状况免疫荧光染色结果

在高糖环境下，1，25（OH）2D3通过阻止FoxO1入核，抑制了FoxO1 的功能。这与之前Zhang 等在非高糖环境下的研究结果相符［16］，1，25（OH）2D3通过PI3K 和AKT 信号通路调控FoxO1，使其磷酸化后阻止其向核内转运，使得FoxO1 的转录活性下调［17］。因此加入1，25（OH）2D3后，FoxO1 与Wnt 通路竞争性结合减少，Wnt 通路促进成骨细胞矿化、抑制凋亡的作用得以体现。此外，1，25（OH）2D3抑制凋亡的作用也可能与Fas 通路相关［18］。当FoxO1功能受到抑制时，MnSOD 等抗氧化酶产生减少，成骨细胞内的活性氧水平提高，异常增殖的趋势理论上会更明显。而本研究发现1，25（OH）2D3抑制高糖环境下成骨细胞的异常增殖，可能有其他信号分子参与了这一调控过程。综上所述，高糖环境会增加成骨细胞异常增殖和凋亡，抑制细胞分化。1，25（OH）2D3可能通过降低高糖环境中成骨细胞中FoxO1 mRNA 表达，阻止FoxO1 向细胞核内转移，逆转高糖环境下成骨细胞的异常增殖、凋亡，促进成骨分化，影响成骨细胞的功能。