非洲猪瘟实时荧光PCR 检测关键要素和实验操作注意事项

莫荣艳

（来宾市动物疫病预防控制中心 546100）

PCR（聚合酶链反应）技术自从1985 年问世以来，经过三十几年的发展，已成为实验室的常规技术。 近年来，PCR 技术有了重大改进。 实时荧光定量PCR 的原理是一种实时监控核酸扩增的技术，在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR 过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。

1 实时荧光PCR 与普通PCR 相比， 实时荧光PCR 具备几个方面的优势

实时荧光PCR 采用封闭的检测模式，闭管反应，杜绝污染；因此扩增产物导致污染的可能性比普通PCR 要小得多。 扩增产物的检测在PCR 扩增过程中同时进行，并且数据的采集、分析全部由仪器自动完成，快捷方便无需电泳，40～60min 完成；检测方法多样， 应用灵活。 整个检测所需的时间比普通PCR 要节省许多。实时荧光PCR 检测模式功能强大，高准确度是目前公认的定量标准；具备定性、定量等检测功能。 而普通PCR 要完成上述项目需采用不同的技术平台。

2 非洲猪瘟实验室检测关键要素

实验室的设计及设施设备、人员的检测能力等都对检测起到关键的要素。 实验室设计及规划非常重要，因为实验室的分区可以减低因污染而导致的实验失败。

2.1 可以将实验室分为四个区域，各区功能如下

试剂配制区：扩增试剂的配制，分装和保存。需要的设备有：冰箱、生物安全柜、微量移液器、离心机。

样品处理区：样品处理和加样。需要的设备有：生物安全柜、微量移液器、离心机、水浴锅、振荡器、可移动紫外灯、匀浆研磨机。

核酸提取区样品核酸提取。 需要的设备有：生物安全柜、自动核酸提取仪（没有这个仪器也可人工核酸提取）。

核酸扩增与分析区：核酸上机扩增并分析结果。 需要的设备有：荧光PCR 仪、UPS 电源（以防止由于电压的波动或停电影响荧光PCR 仪的寿命）、生物安全柜、微量移液器、离心机2 台（一台可离心单管、8 联管，另一台可离心96 孔板）。

2.2 检验员要求

需要大专以上的兽医或微生物相关专业，易于了解检测对象的背景；动作麻利，有耐心，原则性强的人，能够严格遵守操作规程；充分的培训，是得到可靠的实验室检验结果的前提。

2.3 待检测的样品要符合要求，不能受污染、破损、变质等情况

2.4 对试剂做敏感度的验证

新的试剂与旧的试剂进行实验比较；用已知阳性样本，将样品进行一系列的稀释。 用新、旧试剂组成的两个检测系统同时进行测定，新、旧系统对同一份样品的检测时间差异不超过2h，已保证结果的可靠性；比较2 种试剂的检测结果差异。

2.5 符合率验证：用不同厂家的检测试剂做比对

2.6 PCR 实验污染预防： 严格分区实验室及严格遵守工作程序

3 实时荧光PCR 实验操作注意事项

3.1 各区域物品均为专用，不得交叉使用，以免污染。实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。 在试剂配制区和样本处理区配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。

3.2 要严格防止气溶胶交叉污染。不要在生物安全柜以外开启试剂或PCR 管； 禁止在荧光定量PCR 结束后打开PCR 管盖，反应后的PCR 管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启。

3.3 检测试剂使用前在常温下充分融化并混匀，PCR 反应液容易失活，使用时应置于冰盒架上。 严禁使用超过有效期限的试剂；不同批号的试剂请匆混用。 试剂打开使用后应尽快用完。

3.4 所有试剂常温下融化在开启之前都要瞬时离心；吸取反应液等试剂时，尽量避免产生气泡。 荧光探针加完后应该尽快避光保存，加入反应液后尽快上机，以防探针粹灭。

3.5 扩增试剂准备时应按阴性对照、待检核酸、阳性对照的顺序加入PCR 反应管中。PCR 管上方不能用记号笔标记；如果是8 联排管或96 孔板可在板的边缘两端做小的标记；PCR 管使用平盖，96 孔板使用光膜，不要裸手触摸光盖或光膜表面；不能带乳胶手套盖板或盖光膜， 手套上有粉末会影响实验过程中光的吸收，可以带一次性PE 手套来按压PCR 反应管盖或光膜。

3.6 上PCR 仪前，应注意检查各反应管是否盖紧，以免液体蒸发造成结果不准确。加样好的PCR 管要放在离心机上离心15s秒。 PCR 管或8 联排管放置PCR 仪内要平衡对称。

3.7 检测过程中使用过的吸头、 离心管等物品应放到盛有IO%次氯酸的废物缸内，检测结束的PCR 反应管，切忌开盖，其他废弃物品灭菌后做无害化处理。 检测结束后，立即对工作台清洁。 工作台及各种实验用品应定期用75%酒精或紫外灯进行消毒。

综上所述，把控好非洲猪瘟实验室检测关键要素，就能提高工作效率，避免环境污染；在进行荧光PCR 实验时把操作注意事项这些细节做好，就能提高实验的准确率和时效率，避免样品和试剂对环境的污染，也是对检测人员的安全负责。 对每个细节的专注，才能提高检测人员的专业技术水平。