母体免疫系统及血液系统基因多态性与复发性自发流产相关性的研究进展

张万生，谢华，薛智欣，王雪楠，吴迪，孙艳美，潘晓燕*

1吉林医药学院生殖医学研究中心，吉林省吉林市 132013；2吉林医药学院附属465医院泌尿外科，吉林省吉林市 132013；3吉林市中心医院妇科，吉林省吉林市 132602；4济宁医学院附属医院生殖科，山东济宁 272029

复发性自发流产(recurrent spontaneous abortion， RSA)指与同一伴侣孕育的胚胎连续发生两次或两次以上的流产。有研究发现，每一次妊娠的自然流产发生率为10%～15%，RSA的发生率约为1%[1]。RSA的病因十分复杂，主要包括母体子宫结构异常、胚胎染色体异常、母胎的免疫容受性缺陷、血栓形成倾向及胎盘血管形成异常等。其中，遗传因素是引起RSA的常见原因之一。在遗传因素方面，人们已经通过大量的临床研究确定了由于染色体倍性异常及染色体结构异常引起的流产[2]，但仍有约50%不明原因性流产至今无法解释。

近年来，越来越多的研究发现，一些基因的多态性与RSA密切相关，且在不同人种中开展的基因分型研究确定了一些与RSA有关的高风险基因型[3-5]。 表达父系抗原的胚胎进入子宫后，首先要在母体免疫系统的容许下，与具有容受性的子宫内膜建立联系，这一过程受到母体免疫系统基因人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及IL-6等的精确调控[6]，这些基因的表达异常会导致植入失败，提示母体免疫系统基因的多态性可能与RSA有关；其次，胎儿发育的维持需从含有丰富血管的胎盘组织中获取营养物质，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、凝血因子Ⅴ(factor Ⅴ，FⅤ)、凝血因子Ⅻ(factor Ⅻ，FⅫ)、凝血酶激活的纤溶抑制物(thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor，TAFI)及纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor，PAI)等基因在调控胎盘血管形成及血液循环过程中起重要作用[7]，这些基因突变也可能增加RSA的风险。本文从母体免疫系统及血液系统基因多态性方面，对与RSA相关的基因及基因型进行综述，以阐述RSA的发病机制，旨在为预防及治疗RSA提供理论依据。

1 参与子宫内膜容受性建立的基因多态性

子宫内膜容受性指子宫内膜处于一种允许胚胎黏附、侵入的状态，同时侵入的胚胎诱导内膜间质发生蜕膜化，最终胚胎植入子宫内膜，完成整个着床过程[8]。在这一过程中，各种炎性细胞因子聚集在植入位点，参与免疫细胞募集后的炎症反应[9]，使母体对植入的胚胎产生免疫耐受，接受具有父系抗原的胚胎侵入。因此，子宫内膜容受性的获得与炎症反应密切相关，免疫细胞通过炎症反应分泌不同的细胞因子，刺激细胞增殖及分化，并诱导组织重建。

1.1 HLA-G基因多态性 HLA-G是一类免疫耐受分子，高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养层细胞，其基因定位于人第6号染色体短臂HLA-G通过抑制T细胞及NK细胞的细胞毒性作用，在半同种异源的胚胎植入过程中起重要的免疫耐受调控作用。HLA-G有3个多态位点(14-bp INDEL、+3142C-G及+3187A-G)，它们通过影响HLA-G mRNA的稳定性调控HLA-G mRNA的转录水平[10]。Afkhami等[11]发现，-14 bp/-14 bp及+14 bp/+14 bp基因型频率在RSA人群中降低，而+14 bp/-14 bp基因型频率在RSA人群中明显增高。HLA-G 14 bp INDEL多态性可能与RSA有关，但仍须进一步检测血清HLA-G水平以确定这一基因多态性的潜在影响。Hashemi等[12]发现HLA-G 14 bp INDEL多态性与RSA密切相关，且HLA-G 3142G＞C多态性在共显性组(GC vs. GG，OR=2.39，95%CI 1.27～4.49，P=0.010；CC vs. GG，OR=3.28，95%CI 1.16～9.72，P=0.040)及显性组(GC+CC vs. GG，OR=2.52，95%CI 1.37～4.64，P=0.004)提高了RSA的发生风险。Yazdani等[13]分析了100例RSA患者及100例女性健康对照者HLA-G基因启动子区-1573T＞C及-1746C＞A单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与RSA的相关性，结果发现H1(ATCCAGGTACGCAA)及H2(CTTCGAGAACGCAG)这两种单倍型与RSA存在明显的相关性，H1降低了RSA的发生风险，而H2增加了RSA的发生风险。目前有研究发现，在HLA-G基因启动子区、3'-非编码区(UTR)及5'-UTR等区域的不同基因型与RSA均有相关性[13-15]，但为了进一步得出明确的结论，需扩大样本继续重复这些试验。此外，在HLA-G的其他位点也可能存在与RSA相关的重要基因型，因此仍需进一步研究 探索。

1.2 IL1RN基因多态性 炎症反应对处于“植入窗”期的子宫内膜起重要调控作用，炎症反应异常可导致先天性的复发性流产。IL-1β作为促炎性因子，在植入及早期胎盘发育过程中起重要调控作用。IL-1β过度表达会诱导流产的发生，IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist，IL-1ra)可通过与IL-1β受体结合，调控IL-1β在组织中的活性[16]。 IL1RN定位在人染色体2q14区，编码IL-1ra。有研究发现，在IL1RN基因第2内含子中存在可变数目串联重复序列(variable numbers of tandem repeat sequence，VNTR)多态性[17]。Avila-Vergara等[18]对来自墨西哥的108例RSA患者(病例组)及103名健康女性(对照组)进行了IL1RN基因多态性分析，发现病例组的等位基因IL1RN*2发生率为20.8%，高于对照组的5.8%，等位基因IL1RN*2通过编码低功能的IL-1ra蛋白，异常提高了IL-1β的活性，导致RSA的发生，等位基因IL1RN*2与RSA的发生密切相关(OR=4.28，95%CI 2.2～8.4，P＜0.001)。而Hajizadeh等[19]对来自伊朗的140例RSA患者及140名健康女性进行了同样的研究，并未发现IL1RN基因VNTR多态性与RSA相关。Dai等[20]在中国汉族人群体中也未发现IL1RN基因第2内含子中VNTR多态性与RSA相关。因此，种族不同不仅可影响等位基因的频率，也可影响基因多态性与疾病间的相关性。此外，还有一个重要的因素是研究的样本量，有限的样本量很可能会造成统计分析的偏差。

1.3 TNF-α及IL-6基因多态性 TNF-α及IL-6也是参与妊娠免疫调控的重要因子。TNF-α是主要由单核巨噬细胞分泌的一类促炎因子，IL-6是由Th2细胞分泌的细胞因子，可明显促进胚胎着床，降低免疫细胞介导的免疫反应，参与妊娠的维持。RSA患者体内具有较高的血清TNF-α水平及较低的IL-6水平，提示TNF-α及IL-6可能与RSA的发生有关[21-22]。TNF-α及IL-6的基因多态性位点分别为启动子区-238G/A及-174G＞C。Zhao等[23]对43篇文献中RSA患者的TNF-α -238G＞A及IL-6 -174G＞C启动子区多态性进行Meta分析，结果发现，TNF-α -238G＞A在纯合子组(AA vs. GG，OR=1.533，95% CI 1.022～2.301)及隐性组(AA vs. GG+AG，OR=1.571，95%CI 1.050～2.350)与RSA的发生明显相关(P＜0.05)。对于IL-6 -174G＞C，除了隐性组(CC vs. GG+CG，OR=1.166，95%CI 0.938～1.449，P＞0.05)外，其他所有组与RSA间均存在相关性(P＜0.05)。因此，对具有RSA高危因素的女性进行TNF-α -238G＞A及IL-6 -174G＞C基因多态性筛查，可能有助于减少RSA的发生。

1.4 基质金属蛋白酶(MMPs)基因多态性 在胚胎植入时，处于分泌期的子宫内膜发生蜕膜化，细胞外基质在MMPs的作用下发生降解及重塑。MMPs由子宫内膜及胚胎滋养层细胞分泌。研究发现，RSA患者的MMPs基因表达异常可导致母体子宫内膜细胞外基质异常，影响胚胎的植入及妊娠[24]。Pereza等[25]发现，MMP2 -735CT及MMP9 -1562CC的基因型频率在RSA患者中明显增高，这两种基因型可能是引起RSA的危险因素。同样，Li等[26]在中国人群中也发现MMP2 rs243865及MMP9 rs3918242的基因多态性与RSA的发生明显相关。2017年，Barišić等[27]扩展了对不同MMP基因多态性的研究，但未发现MMP7 -181A/G及MMP12 -82A/G与RSA的发生相关。调控胚胎植入及维持妊娠的基因复杂多样，因此，须进行大量研究以进一步探索与RSA有关的主要基因及基因型。

2 参与形成血栓前状态的基因多态性

血栓前状态是指多种因素引起的止血、凝血、抗凝障碍及纤溶系统功能失调，使机体出现凝血功能异常增高、纤溶功能降低，形成血液的高凝状态。母体血液高凝状态可引起子宫胎盘部位血流状态改变，局部组织易形成微血栓及胎盘梗死灶，使胚胎缺血缺氧，最终导致胚胎发育不良或流产。参与凝血、抗凝及纤溶有关的基因突变是产生这一病理状态的遗传学基础，也是导致RSA的重要母体 因素。

2.1 参与凝血、抗凝的基因多态性 造成血栓前状态的遗传因素是由一些具有形成血栓倾向的基因突变引起的，其中最常见的是凝血因子Ⅴ基因Leiden(FⅤL)突变及凝血酶原基因突变。RSA患者FⅤL突变发生率为3%～42%[28]。FⅤL突变是一种常染色体显性遗传病，在FⅤ基因的核苷酸序列1691位点上发生了谷氨酰胺对精氨酸的错义突变，氨基酸序列506位点的精氨酸被谷氨酰胺取代。活化蛋白C是一种天然抗凝血剂，通过在氨基酸506位点处裂解FⅤ，使FⅤ失活，阻止血液凝固。FⅤL突变可阻止FⅤ的失活，活化的FⅤ可稳定凝血酶原复合物，增强凝血酶原的活化，最终增加血栓形成的风险。Kashif等[28]发现，RSA患者FⅤL突变发生率为5.4%，而在健康女性对照组中未发现此突变，提示FⅤL突变与RSA密切相关。Barut等[29]也发现杂合子型的FⅤL H1299R与RSA具有明显相关性(P＜0.01)。但宋绿茵等[30]通过分析中国广东地区妇女FⅤL突变情况发现，该突变与中国广东地区妇女RSA的遗传易感性无关。究其原因，可能是基因分布频率受种族、地域等多种因素影响，致使不同种族及人群的FⅤ基因多态性存在差异；也可能是其他与血栓前状态相关的基因参与了RSA的发生。因此，对于中国广东地区人群中与RSA相关的基因及基因型的确定还需要进一步分析及筛查。

患者处于血栓前状态时，血液的高凝状态不一定导致严重的血栓性疾病，但可引起凝血功能增强及纤溶功能降低。凝血因子Ⅻ(FⅫ)是一种80 ku的丝氨酸蛋白酶，在体内并不是重要的促凝因子，但在抗血栓及促进纤溶功能中发挥着重要作用。在FⅫ基因启动子区第46 nt处发现了C/T多态性。46C/T多态性为mRNA创造了一个新的起始密码子(ATG)，妨碍了翻译起始位点的正确识别，降低了FⅫ的翻译效率，最终导致血浆中Ⅻ因子水平降低[31]。 Asano等[32]发现，FⅫ活性较低(＜39%)女性的流产率明显高于FⅫ活性正常的女性，RSA组的CT基因型分布频率(53.1%)较正常对照组(38.0%)明显升高，CT基因型是RSA的危险因素(OR=2.8，95%CI 1.37～5.85)。金艳慧等[31]对来自中国浙南地区的203例RSA患者及171名无不良妊娠史的健康女性进行了FⅫ基因46C/T多态性检测，也发现RSA患者中FⅫ基因CT基因型的比例较高，提示FⅫ基因CT基因型可能是浙南地区育龄期女性发生RSA的危险因素 之一。

2.2 参与纤溶的基因多态性 TAFI是一种人血浆酶原，是近年来国内外医学界研究凝血及纤溶调控因子的热点之一。TAFI是由401个氨基酸组成的单链血浆蛋白，以无活性的酶原形式在血液中循环。凝血酶、凝血酶-血栓调节蛋白复合物及纤溶酶在TAFI的第92个Arg位点将其裂解，产生活化的TAFI(TAFIa)。TAFIa可将纤维蛋白羧基端赖氨酸位剪切，从而阻止纤维蛋白与纤溶酶原及组织纤溶酶原激活物的结合，减少纤溶酶的产生，最终导致纤溶作用减弱，增加了血栓形成的风险。Juhan-Vague等[33]研究发现，当血浆TAFI浓度＞129 nmol/L 时，可使血栓形成的危险性增加1倍；此外，还发现TAFI 1040C/T多态性可改变血液中的TAFI水平，影响TAFIa的纤溶作用，据此推测TAFI 1040C/T多态性可能与RSA有关。ElDanasori等[34]通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术分析了TAFI 1040C/T在RSA患者及健康女性中的发生频率及相关性，结果发现，虽然T等位基因在RSA患者中具有较高的频率，但差异无统计学意义，且CC及TT基因型与RSA无相关性(P=0.71)，提示TAFI 1040C/T尚不能作为RSA的一个预测因子。但Abulata等[35]发现，当eNOS突变与TAFI 1040C/T 突变同时发生时，会使R SA的发生风险提高1.5倍，提示可能一些基因的连锁突变会影响某项生理活动，进而导致疾病的发生。纤溶酶原激活物抑制剂1型(PAI-1)也是一类调节纤维蛋白溶解的重要分子，研究发现其启动子区-675G/A(4G/5G)及-844G/A变异与血栓风险增加相关[35]。Barut等[29]的研究也发现PAI-1 4G/5G及PAI-1 4G/4G的SNP与RSA明显相关。Cao等[36]利用质谱技术分析了6个血栓形成倾向基因[SERPINC1(G786A)、THBD(C1418T)、TFPI(T-33C)、FⅤL(G1628A)、F2(A19911G)及ANXA5(G76A)]的多态性，发现只有THBD(C1418T)多态性与RSA密切相关。由于血栓的形成原因复杂，参与表达的基因众多，因此，需扩大样本量进行大量的实验筛选，以确定与RSA有关的分子基因型。

3 参与胎盘血管形成的基因多态性

胎盘是妊娠期胎儿在母体内生长及发育的重要器官，胎儿通过胎盘血液循环系统与母体进行气体交换，获得营养物质并排泄代谢产物。胎盘血管网络形成及充足的血液灌注量是保障胎儿正常生长发育的重要因素。胎盘血管形成异常将直接导致流产。

3.1 VEGF基因多态性 VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，是血管生成的主要诱导因子，对刺激滋养层细胞增殖及胚胎血管系统发育至关重要。有研究利用血管生成抑制剂AGM-1470处理怀孕小鼠，以干扰VEGF调控的胎盘血管发育，结果显示胚胎生长失败[37]。An等[38]研究了VEGF 3'-UTR区的SNP[rs3025040 (1451C＞T)、rs10434 (1612G＞A)、rs3025053 (1725G＞A)]与RSA的关系，结果发现，RSA组与正常对照组的rs10434 (1612G＞A)(GG vs. GA，OR=0.476，95%CI 0.293～0.774；GG vs. GA+AA，OR=0.446，95% CI 0.280～0.710)以及rs3025053 (1725G＞A)(GG vs. GA，OR=0.413，95%CI 0.207～0.825；GG vs. GA+AA，OR=0.381，95% CI 0.192～0.755)基因型频率差异有统计学意义(P＜0.05)，提示VEGF基因多态性与RSA的发生密切相关。Saboori等[39]检测了100例RSA患者及100名健康女性的VEGF基因在+936C/T(rs3025039)、-1154G＞A (rs1570360)、rs3025010及+5092A/C(rs2146323)4个位点的多态性，结果发现，-1154G/A杂合基因型(GA)与RSA存在相关性，VEGF内含子区(rs3025010)的SNP也与RSA相关。Pereza等[40]分析了血管内皮生长因子A(VEGFA)基因启动子区域-2549插入/删除(I/D)的多态性与RSA是否存在关联，结果发现，在女性中-2549I/D多态性与RSA无关联性；而携带DD基因型的男性与携带ID及II基因型的男性相比，其配偶发生RSA的风险增加了1.75倍(95%CI 1.05～2.93，P=0.032)，提示男性VEGFA基因中的-2549 I/D多态性可能与其配偶发生RSA有关。Vidyadhari等[41]发现，胎儿及母体中A1154D2549A2578T936单倍型VEGF显示出更高的RSA风险，而G1154I2549A2578C936单倍型VEGF则与RSA存在低风险的关联。VEGF基因上存在多个与RSA具有相关性的多态性位点，且这些位点间相互关联，共同影响RSA的发生。

3.2 eNOS基因多态性 胎儿胎盘血管缺乏自主神经支配，胎侧界面的血管功能调节是由内皮细胞来源的血管活性介质(包括eNOS)介导的，并参与调控一氧化氮(NO)的生成。由eNOS催化产生的NO参与调节血管舒张、激活内皮祖细胞及抑制血小板聚集等过程。eNOS基因突变主要表现为第4内含子中VNTR多态性及+894 G/T SNP多态性。Pereza等[42]通过Meta分析研究894例RSA患者及944名健康对照女性第4内含子中VNTR的多态性，以及1111例RSA患者及1121名健康对照女性+894 G/T SNP的多态性，发现+894 G/T的GT及TT基因型(OR=1.54，95%CI 1.28～1.86，P＜0.01)与RSA明显相关。Zhao等[43]发现eNOS第4内含子中VNTR A/B、G894T、C786T与R SA明显相关。因此，进一步研究与不明原因复发性自发流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)密切相关的4VNTR A/B、G894T、C786T eNOS基因型，对高危女性RSA的筛查及预防具有重要意义。

4 总结与展望

目前，对RSA相关基因多态性的研究主要集中在参与妊娠活动的主要基因上。但是，由于基因表型复杂，因此不能忽视对一些次要基因的研究，否则容易造成结果的片面性；且基因多态性易受地域及人种的影响，也是需要考虑的一个重要因素。此外，采用基因分析的RSA患者较少(大部分研究不超过300例)，存在部分与RSA密切相关的基因型由于发生频率低或样本量少而无法被发现的情况。即使部分基因型被发现与RSA密切相关，但大多数缺乏导致妊娠失败的功能性研究。因此，须在扩大样本进行大量的实验筛选并结合功能性研究后，才能确定与RSA密切相关的基因型，从而用于临床对RSA的筛查及预防。