基于核酸适配体检测平台的设计模式*

刘小慧 彭 虎，2 张艳琼

（三峡大学，1 医学院，2 肿瘤微环境与免疫湖北省重点实验室，宜昌 443002）

适配体是短单链寡核苷酸（DNA或RNA）或肽类，它们通过折叠成三维结构可识别几乎所有类型的靶点，如金属离子、毒素、药物、蛋白质和细胞[1]。核酸适配体易被功能基团修饰，可构建特异性的分子探针。由于核酸适配体及其识别靶标所产生的生物信号可被传感器识别，并被转化为可探测的信号，可被用于设计多种传感器。因而，基于核酸适配体的检测平台可以分为核酸适配体探针和核酸适配体传感器，两者都被广泛用于生物检测。核酸适配体具有以下优点：核酸适配体非常稳定，即使在热变性后也能恢复其活性构象；高纯度的核酸适配体可被重复合成，并且通过分离和回收，核酸适配体可以在不失去活性的情况下被重新利用[2]。因此，基于核酸适配体的检测平台有望成为临床诊断的重要工具。根据分子探针的设计策略，核酸适配体检测平台分为常开模式、靶向诱导的结构改变模式和竞争性替换模式，现对3种模式的设计基本原理及其优点做一综述。

1 常开模式

在常开模式（always-on mode）的设计中，采用分子标签修饰核酸适配体以达到追踪靶标的目的。分子标签通常是荧光团和纳米粒子。在这种设计策略下，被标记的核酸适配体与靶标结合，分子标签在靶标周围逐渐积累。因而相对于背景，检测信号也逐渐增强。这种设计模式的特点是不必激活即可产生恒定的检测信号[3]。

1.1 荧光团标记的核酸适配体探针

荧光团标记的核酸适配体探针，由于其优异的灵敏度和成本低而被广泛应用，是一种重要的临床诊断工具。荧光团通常连接在核酸适配体序列的末端，因为这种空间结构对靶标识别的阻碍较小，且不易导致荧光猝灭。通过荧光显微镜或流式细胞术分析，就能确定靶标的时空分布。此外，通过静脉注射核酸适配体探针，也可在体内进行实时分子成像。Zhang等[4]针对这种常开设计模式的初步研究结果提示，核酸适配体和抗体可以协同使用，提高了淋巴瘤的诊断水平。除了能够在简单的系统中识别一种靶细胞或分子，荧光团标记的核酸适配体还能识别不同类型的癌症，甚至在复杂的样本中识别它们的亚型[5]。Yuan 等[6]的研究结果显示，特异性结合淋巴结组织的核酸适配体，在结直肠癌转移中的总检出率为73.9%，而无转移或癌旁组织的检出率较低。同样，Wang等[7]也使用核酸适配体识别具有类似致瘤潜力，但转移性相反的细胞系。体内荧光成像和临床组织成像也清楚地表明，核酸适配体可以达到显著的靶向效率。因此，荧光团标记的核酸适配体有望成为转移癌诊断的分子探针，并通过跟踪荧光标记实现实时空间成像。

1.2 纳米粒子标记的核酸适配体探针

纳米粒子标记的核酸适配体探针可以用于临床检测，甚至是在血液等复杂系统中提取靶标的理想工具。迄今为止，各种各样的纳米粒子被用来标记核酸适配体，包括聚合物纳米粒子、介孔二氧化硅纳米粒子、金属纳米粒子、量子点和碳纳米管。由于核酸适配体分子量低，可以将其固定在纳米粒子表面，形成核酸适配体-纳米粒子体系。纳米粒子与核酸适配体的偶联方法可分为共价偶联和非共价偶联。在共价偶联中，核酸适配体可以通过化学键与量子点表面结合。例如，在1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二亚胺的催化下，羧基标记的量子点与氨基标记的核酸适配体偶联。非共价偶联是基于生物分子之间的特定相互作用。利用生物素和链霉亲和素之间的特异性相互作用，量子点可以与核酸适配体结合。量子点是近球形的荧光纳米晶体，直径为2～20 nm，由Ⅳ、Ⅱ～Ⅵ、Ⅳ～Ⅵ或Ⅱ～Ⅴ族元素组成。量子点具有较高的量子产率、快速的发射速率、较强的耐光漂白性、化学稳定性和非闪烁的特性[8]。并且，量子点与核酸适配体的结合不会引起激发峰发生位移[9]。纳米材料还可以保护核酸适配体不被检测环境中的核酸酶降解[8]。因此，在体内成像方面，量子点可以替代荧光团（如5-氨基乙酰磺酸和荧光素钠）来标记核酸适配体，从而提高临床诊断的敏感性和选择性[10]。量子点标记的核酸适配体也可以用于荧光引导手术，它可以勾画肿瘤边界，最大限度地实现了肿瘤安全切除[11]。因此，量子点标记的核酸适配体探针在肿瘤的分子诊断、影像引导手术和术后检查等方面具有良好的应用前景。此外，量子点标记的核酸适配体还可以用于多重成像。由于量子点特定的光学和电化学性质随其尺寸的改变而变化，并且量子点的吸收光谱宽，发射光谱窄而对称[12]。量子点标记的核酸适配体探针可以通过显示不同的颜色，来评估不同基因在单个细胞中的表达[13]。因而，在体外，多种的量子点可同时应用于癌细胞的多重成像。

目前，多模态分子成像正逐渐成为主流。由于每一种成像方式都有优缺点，它们的集成可以带来进一步的结构和功能改进。最常用的多模态探针涉及磁共振成像（magnetic resonance imaging， MRI）和光学成像的结合。MRI具有较高的空间分辨率，同时它还拥有获取生理和解剖信息的能力。其中，高密度顺磁超细氧化钆纳米粒子作为T1造影剂可以标记核酸适配体，使质子弛缓增强，且有较低的检测限度[14]。而光学成像又提供了高灵敏度。如果2种纳米颗粒的比例适当，则荧光发射和MRI信号都能增强[15]。虽然常开模式的设计结构简单，制备要求不复杂，但由于靶向结合产生的信号有限，灵敏度相对较低。同时，利用各种信号放大方法来研制高灵敏度的生物传感器是十分不易。因此，这种设计方法有一定的局限性，近年来鲜有新进展。

2 靶向诱导的结构改变模式

在靶向诱导的结构改变模式（traget-induced structure switching mode）中，核酸适配体优先与靶标结合，从而改变了原设计的结构。其特点是核酸适配体与靶标结合的构象变化导致了检测信号的转导，包括光的散射和吸收特性等。这种模式的核酸适配体探针又可以根据是否改变自身的三维结构，分为“打开”和“关闭”2种模式。探针和靶标的结合作为开关控制信号的转导。在这种设计模式中，最常运用的原理是荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）。FRET的发生与供体和受体的空间距离（通常为1～10 nm）密切相关[16]。当应用核酸适配体进行基于FRET的分析时，利用核酸适配体的特异性识别，使供体和受体处于距离合适范围内，从而触发FRET[17-18]。荧光染料、量子点和聚合物被广泛用作能量供体[17]。

2.1 “打开”核酸适配体探针模式

在“打开”核酸适配体探针模式中，检测的信号强度随靶向结合的增多而增加。荧光团与猝灭剂通过共价结合形成复合物，该复合物使荧光完全猝灭。但将荧光团与猝灭剂隔离后，荧光淬灭反应减弱，从而荧光恢复。这种机制在“打开”模式中应用最为广泛。Ma等[19]设计了2条核酸适配体的互补序列，在序列末端分别修饰了荧光团和猝灭剂。核酸适配体可以结合荧光团标记的互补链和猝灭剂标记的互补链，从而使猝灭剂有效地猝灭荧光团的荧光。而当靶标存在时，核酸适配体倾向于和靶标结合，导致结构逆转，荧光恢复。该核酸适配体感受器的检测限度为0.70 ng / mL。此外，近红外的量子点可在近红外检测窗口（650～900 nm）被检测到，避免了以生物基质为背景的干扰。Wang等[20]运用这种新型的近红外-FRET模式，检测到了0.6 pmol/L胰岛素。除了近红外的量子点外，镧系上转换纳米粒子（lanthanidedoped upconversion nanoparticles） 作为高效的能量供体可用于复杂样品的检测[21]。

2.2 “关闭”核酸适配体探针模式

Cho等[22]提出了一种“关闭”核酸适配体探针设计模式。在传统检测方法中是通过测量颜色变化或荧光猝灭监测核酸适配体与靶标的相互作用，但受传感器灵敏度或相关检测复杂性的限制。例如，比色测定或荧光猝灭需要收集大量的纳米粒子，以获得可识别的颜色变化或荧光信号。因此，表面增强荧光（surface-enhanced fluorescence， SEF）的运用，在很大程度上增强了荧光信号。Cho等[22]研究显示，当靶标缺失时，血管内皮生长因子（VEGF）165核酸适配体被展开，与包覆在金纳米粒子表面的带正电荷的多聚赖氨酸结合，从而激发Cy3- VEGF165核酸适配体的SEF。当VEGF165核酸适配体遇到靶标时，由于静电结合力降低，构象改变的核酸适配体又从金纳米粒子表面释放。因此，从金纳米粒子表面不可逆性地分离核酸适配体，避免了Cy3-VEGF165核酸适配体的SEF效应，使检测VEGF165的灵敏度得到了极大提高。但是，由于信号-背景比率（signal-tobackground ratio）较低，又存在非特异性吸附及猝灭剂的干扰，“关闭”模式受到假阳性结果的限制。相比之下，“打开”模式没有背景信号的影响。

3 竞争性替换模式

竞争性替换模式（competitive replacement mode）是基于分析物（靶标）与核酸适配体竞争结合的原理，从而能够获得检测信号。其特点是竞争者可以是核酸适配体修饰的目标分析物或与核酸适配体互补的DNA序列。

3.1 核酸适配体-目标分析物作为竞争者

在核酸适配体-目标分析物作为竞争者的模式下，首先制备目标分析物，并与核酸适配体结合，然后，将基于该核酸适配体-目标分析物的生物传感器添加到分析物中。游离的分析物将从核酸适配体-目标分析物中竞争核酸适配体，从而引起检测信号的变化。Jackson等[23]设计了一种基于FRET的鱼腥藻毒素-a （anatoxin-a，ATX-A）传感器。核酸适配体的末端修饰了猝灭剂，然后与实验前准备的ATX-A结合，并被固定在量子点表面。因此，量子点的荧光由于FRET作用被猝灭剂阻断。当暴露于游离的ATX-A时，核酸适配体被释放，猝灭剂离开量子点表面，荧光恢复。检测信号与被测样品中的ATX-A浓度成正比。而Gao等[24]将生物膜干涉术（biolayer interferometry）与酶联核酸适配体结合，从而实现了快速、灵敏地检测较低浓度的目标分析物。在该实验中，样品中游离的水螅毒素（palytoxin）竞争性地结合固定在生物传感器上的核酸适配体。由于生物传感器的光学厚度和质量密度发生了较大变化，导致反射光的干涉谱发生变化，放大了检测信号，使得检测到的光学信号与样品中游离PTX的浓度成反比。

3.2 核酸适配体的互补DNA序列作为竞争者

在核酸适配体的互补DNA序列作为竞争者的模式下，核酸适配体既可以与其互补的DNA序列结合，也可以与靶标结合，它们之间存在竞争。当核酸适配体与靶点结合时，未结合的DNA序列会引起检测信号的变化。Borghei等[25]基于比色分析法，将核酸适配体运用于癌症的早期检测。他们将单链DNA探针功能化，使这2种探针在核酸适配体的2个特异位点上均有互补序列，然后与金纳米粒子结合。当靶细胞不存在时，金纳米粒子通过核酸适配体与单链DNA探针杂交而聚集，导致其吸收光谱发生位移。引入靶细胞后，靶细胞与单链DNA探针竞争性结合核酸适配体，导致样品的颜色和吸收光谱发生变化。该设计策略的检测限度为10个细胞，可推广应用于各种癌细胞的精准检测。

综上所述，常开模式结构简单，但由于该模式的信号恒定，清除未结合的核酸适配体探针需要较长的时间，这不仅导致诊断时间较长，而且高背景影响了图像的对比度。此外，为了增加检测的灵敏度，常开模式消耗了大量的核酸适配体探针，这将进一步降低靶标与背景之间的对比度。因此，用于检测生物分子的理想设计，最好具有靶标诱导结构改变的特性，即与靶标成功地结合后，才能激活信号。相比之下，靶向诱导的结构改变模式便具有更好检测灵敏度。而竞争性替换模式的检测程序较复杂，但表现出高灵敏度和低检出限度。因而，靶向诱导的结构改变模式和竞争性替换模式或是未来构建核酸适配体检测平台的关注重点。