紫草素对人白血病MV4-11细胞的增殖抑制和促凋亡作用

苏 龙，张云蔚，王 卓，宋 飞，秦田雪，高素君

(吉林大学第一医院肿瘤中心血液科，吉林 长春 130021)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者FMS样酪氨酸激酶3受体基因内部串联重复序列(FMS-like tyrosine kinase-3 receptorinternal tandem duplication, FLT3-ITD)突变的发生率为20%～30%，FLT3-ITD突变AML危险分层属于高危组，预后不良[1-3]。微小RNA(microRNAs)在髓细胞分化和白血病发生中均发挥十分重要的作用，microRNA-155(miR-155)是AML的不良预后指标之一[4]。在FLT3-ITD突变AML患者中， miR-155表达明显上调[5]。有文献[6]报道：通过靶向药物干扰miR-155表达，可诱导白血病细胞凋亡且能够延长白血病小鼠的生存期。miR-155可能是FLT3-ITD突变AML的理想治疗靶点之一。尽管紫草素的抗肿瘤作用在实体肿瘤中被广泛报道，但有关其抗白血病作用的研究[7-9]较少。紫草素对FLT3-ITD突变AML是否有作用目前尚不清楚，且紫草素对miR-155表达是否有影响亦无文献报道。本研究采用人FLT3-ITD突变AML MV4-11细胞为研究对象，探讨紫草素对其增殖抑制和促凋亡作用，初步阐明其分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 MV4-11细胞系购自中国科学院(上海)细胞库，培养于含10%胎牛血清(美国Gemini公司)和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基(美国赛默飞世尔公司)中。紫草素购自上海纯优生物有限公司，采用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成10 g·L-1储存液备用。CCK-8试剂盒(上海东仁化学科技有限公司)，Annexin Ⅴ-FITC/7-AAD试剂盒(美国BD公司)，RNAiso Plus试剂盒[宝生物(大连)有限公司]，miRcute miRNA提取分离试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，Real-time PCR试剂盒(美国赛默飞世尔公司)。流式细胞仪(美国BD公司)，酶标仪(美国BioTek公司)，PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率，具体操作参照试剂盒说明书进行。取生长状态良好的MV4-11细胞，在96孔板中配制100 μL的细胞悬液(调整细胞密度为5×104mL-1)。MV4-11细胞经不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0和 8.0 μmol·L-1)紫草素处理24和 48 h，同时设不加紫草素的DMSO组作为对照，每孔加入10 μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1.5 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)值。每组设3个平行孔，实验重复3次。计算24和 48 h 时紫草素的半数抑制浓度(IC50)。按公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=[1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)] × 100%。

1.3 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CSFE)标记法检测细胞增殖率 取生长状态良好的MV4-11细胞，采用CFSE预孵育8 min。在96孔板中配制100 μL的细胞悬液(调整细胞密度为5×104mL-1)。MV4-11细胞经不同浓度(0.25、0.50和1.00 μmol·L-1)紫草素处理48 和72 h，同时设空白对照组和DMSO组。采用流式细胞仪检测各组CFSE标记细胞百分率，即细胞增殖率。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 采用不同浓度(1/2×IC50、IC50和2×IC50)紫草素处理MV4-11细胞24～48 h，同时设不加紫草素的DMSO组作为对照。收集用于凋亡检测的细胞，1 000 r·min-1离心5 min，去除培养基，PBS冲洗2次，加入Anexin Ⅴ-FITC 5 μL 和7-AAD 5 μL，轻柔弹起混匀，4℃避光孵育30 min。1 h内采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3次。

1.5 Real-time PCR法检测细胞中miR-155表达水平 MV4-11细胞分为DMSO组和不同浓度(1/4×IC50、1/2×IC50和IC50)紫草素组，处理48 h后，采用RNAiso Plus试剂盒和miRcute miRNA提取分离试剂盒提取总RNA，具体操作参照说明书。采用逆转录试剂盒进行反转录，采用Real-time PCR试剂盒检测基因表达，以2-ΔΔCt法计算miR-155的相对表达水平，实验重复3次。相关引物序列如下：Human U6，F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R 5′-AACGCTTCACGAA-

TTTGCGT-3′；miR-155，F 5′-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3′， R 5′-GCTGTCAACG-

ATACGCTACCTA-3′。

2 结 果

2.1 各组细胞增殖抑制率和增殖率 采用不同浓度紫草素(0.5～8.0 μmol·L-1)处理MV4-11细胞24～48 h，CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率，结果显示：与DMSO组比较，不同浓度紫草素组MV4-11细胞的增殖抑制率明显升高(P<0.05或P<0.01)，且随着紫草素浓度的升高各组细胞增殖抑制率逐渐升高(表1)。根据不同浓度紫草素组细胞的增殖抑制率结果计算，24和48 h时紫草素的IC50分别为1.743 (1.468～2.118) μmol·L-1和1.404 (1.228～1.612) μmol·L-1。不同浓度紫草素(0.25、0.50和1.00 μmol·L-1)处理MV4-11细胞48和72 h，采用CFSE标记法检测各组细胞增殖率，结果显示：与空白对照组和DMSO组比较，不同浓度紫草素组细胞增殖率均明显降低。见图1。

表1 不同浓度紫草素作用24和48 h时各组MV4-11细胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of MV4-11 cells in various groups after treated with different concentrations of shikonin for 24 and 48 h

*P<0.05,**P<0.01 compared with DMSO group.

2.2 各组细胞凋亡率 作用48 h时紫草素的IC50为1.404 μmol·L-1。MV4-11细胞经不同浓度[0.702(1/2×IC50)、1.404(IC50)和2.808 μmol·L-1(2×IC50)]紫草素处理48 h，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，结果显示： DMSO组和紫草素0.702、1.404及2.808 μmol·L-1紫草素组细胞凋亡率分别为(7.96 ± 1.39)%、(11.33 ± 4.28)%、(21.02 ± 3.59)%和(23.65 ± 2.65)%，与DMSO组比较，不同浓度紫草素组细胞凋亡率明显升高(P<0.01)，且呈剂量依赖性。见图2。

2.3 各组细胞中miR-155表达水平 不同浓度紫草素处理MV4-11细胞48 h，采用Real-time PCR法检测各组细胞中miR-155表达水平，结果显示：与DMSO组比较， 0.702和1.404 μmol·L-1紫草素组细胞中miR-155表达水平明显降低(P<0.01)； 1.404 μmol·L-1紫草素组细胞中miR-155表达水平降低超过75%。见图3。

A-E: 48 h; F-J: 72 h; A, F: Blank control group; B, G: DMSO group; C, H: 0.25 μmol·L-1shikonin group; D, I: 0.50 μmol·L-1shikonin group; E, J: 1.00 μmol·L-1shikonin group.
图1 CFSE法检测各组MV4-11细胞增殖率
Fig.1 Proliferation rates of MV4-11 cells in various groups determined by CFSE method

A: DMSO group；B: 0.702 μmol·L-1 shikonin group；C: 1.404 μmol·L-1 shikonin group；D: 2.808 μmol·L-1 shikonin group.图2 不同浓度紫草素作用48 h时各组MV4-11细胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of MV4-11 cells in various groups after treated with different concentrations of shikonin for 48 h

*P<0.01 compared with DMSO group.A: DMSO group; B: 0.351 μmol·L-1shikonin group; C: 0.702 μmol·L-1shikonin group; D: 1.404 μmol·L-1shikonin group.
图3 不同浓度紫草素作用48 h时各组MV4-11细胞中miR-155表达水平
Fig.3 Expression levels of miR-155 in MV4-11 cells in various groups after treated with different concentrations of shikonin for 48 h

3 讨 论

FLT3-ITD突变是AML最常见的基因突变，为AML的不良预后分子标志之一。与野生型患者比较，FLT3-ITD突变患者具有骨髓原始细胞高、外周血白细胞高、初始诱导治疗缓解率低、早期死亡率高和复发风险高等特点，采用联合化疗患者长期存活率仅为20%～30%[10-12]。异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)是目前唯一有望彻底治愈FLT3-ITD突变AML患者的治疗手段。多项研究[13-14]显示：FLT3-ITD突变是接受allo-HSCT患者的不良预后指标之一，与野生型患者比较，FLT3-ITD突变患者allo-HSCT后复发率更高且存活期更短。但也有研究[15-17]报道：FLT3-ITD突变对allo-HSCT后患者预后无明显影响。上述研究结果的差异可能与预处理方案、移植类型和移植后抢先干预手段等不同有关。因此，allo-HSCT是否可逆转FLT3-ITD突变AML患者的不良预后尚存在一定争议。近年来靶向药物在治疗FLT3-ITD突变AML患者治疗中取得一定进展[18]。2017年《新英格兰杂志》报道了应用米哚托林治疗FLT3-ITD突变AML患者临床试验的结果，结果显示：米哚托林组患者4年的无疾病生存率和总生存率分别为51.4%和28.2%，安慰剂组为44.3%和20.6%[19]。尽管患者可以从米哚托林治疗中获益，该药也已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗FLT3-ITD突变AML患者，但目前国内患者无法使用且疗效改善仍有限。FLT3-ITD突变AML患者的治疗仍有待改善。

FLT3-ITD突变可导致受体持续活化，进而激活一系列下游信号分子，如核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)，后者可通过结合miR-155的启动子进而上调miR-155表达；miR-155可抑制SHIP1、PU.1和CCAAT增强子结合蛋白A(CEBPA)表达，SHIP1是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的抑制物，而PU.1和CEBPA是髓细胞分化过程中十分重要的转录因子。因此，FLT3-ITD突变可导致造血细胞分化受阻并大量增殖，并最终形成急性白血病[5]。多项研究[4, 20-21]表明：FLT3-ITD突变AML患者miR-155表达水平明显升高，且为AML的不良预后因素之一。动物实验[6]表明：抑制白血病小鼠miR-155表达可明显延长小鼠的生存期。因此，调控miR-155可能是治疗FLT3-ITD突变患者的重要策略之一。

已有研究[7-9]报道：紫草素具有抗白血病效应。紫草素可通过含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)途径诱导人类急性早幼粒细胞白血病HL60细胞系凋亡[7]。在BCR-ABL阳性慢性粒细胞白血病细胞中，紫草素可通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)/ c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)途径诱导细胞凋亡[8]。近来有研究[9]报道了紫草素杀伤U937白血病细胞的新机制，紫草素可能通过细胞外调节蛋白激酶(ERK)/JNK/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和AKT通路抑制c-MYC基因进而诱导细胞凋亡。然而，紫草素对人FLT3-ITD突变AML细胞系是否有作用目前并不清楚。本研究结果显示：紫草素对MV4-11细胞系具有明显的增殖抑制作用和促凋亡作用，紫草素可明显下调MV4-11细胞中miR-155的表达水平。NF-κB通过结合miR-155启动子进而调节miR-155表达[15]。既往研究[22-23]报道：紫草素通过NF-κB发挥其主要生物学功能。因此，本文作者推测：紫草素可能通过抑制NF-κB入核进而下调miR-155的表达。此外，紫草素是否对miR-155下游信号分子有作用、是否可促进白血病细胞分化等尚有待进一步研究证实。

紫草素治疗AML具有一定优势。AML患者处于免疫低下状态，加之化疗，使患者的免疫力再次受到打击，细菌和真菌感染的发生率高，而紫草素具有一定的抗细菌和抗真菌感染能力[24]。关于药物安全性问题，本课题组的前期研究[25]并未发现紫草素及其衍生物具有明显的急性及慢性毒性反应：急性毒性实验采用小鼠模型，最大给药剂量为1 g·kg-1；慢性毒性实验采用大鼠模型，最高剂量为800 mg·kg-1灌胃，连续6个月。

综上所述，紫草素可抑制FLT3-ITD突变人白血病MV4-11细胞的增殖，促进细胞凋亡。此外，紫草素可下调AML不良预后分子miR-155的表达，进而有可能逆转或部分逆转FLT3-ITD突变AML患者的不良预后。因此，紫草素可作为FLT3-ITD突变AML的潜在治疗药物之一。