加减薯蓣丸调节转录因子EB介导的自噬溶酶体通路改善APP/PS1小鼠学习记忆能力研究

邱 静，鄢文静，张雨婷，谭子虎，杨 琼

(湖北中医药大学中医临床学院，湖北 武汉 430061)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是与年龄相关的痴呆症中最常见的类型，可导致严重的不可逆的认知衰退和大量神经变性[1]。AD发病机制复杂，目前还缺乏明确有效的防治药物。中医药在辨证论治、整体观念指导下，针对AD等复杂疾病具有一定的优势。中医认为AD的病机特点为脾肾亏虚、痰瘀互结。本课题组根据AD病机特点组方加减薯蓣丸，在前期的临床观察中发现加减薯蓣丸可以提高轻、中度AD患者简易智能状态量表评分，改善日常生活能力，同时可以降低中医证候积分[2]。但加减薯蓣丸在改善AD症状中的作用机制尚未明了，因此本研究应用APP/PS1双转基因小鼠模型，研究加减薯蓣丸具体作用效应及其可能机制，为药物临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级5月龄健康雄性APP/PS1双转基因小鼠(B6C3-TgAPPswe/PS1de9)20只，购于南京大学模式动物研究所，动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0008，体质量(33.7±3.2)g。饲养于湖北省中医院SPF级实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2017-0095]。温度(21±3)℃，相对湿度(60±5)%，自由摄食摄水，12 h明暗交替。

1.2 实验药物 加减薯蓣丸浓缩剂(又名薯蓣健脾益智合剂，由湖北省中医院制剂中心制备，批准文号：鄂药制字Z20150027，批号 20190101)，组方：山药30 g，制何首乌、熟地黄各24 g，党参、白芍、当归各20 g、麸炒白术、茯苓、枸杞子各18 g，石菖蒲14 g，杜仲、远志各12 g，川芎、五味子各10 g。上14味中药，加水煎煮3次，每次1 h，过滤后合并滤液，经物理方法浓缩提纯而成口服液250 mL，生药含量1 g/mL，真空包装，4 ℃冷藏备用。

1.3 主要试剂 RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天，ECL底物液购于Thermo；二抗购于武汉博士德，微管相关蛋白3(microtubule-associated light chain3，LC3)B(14/16 kD)、组织蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)、溶酶体膜相关蛋白1(lysosomal-associated membrane proteins 1，LAMP1)、P62购于CST；β淀粉样蛋白42(amyloid-β42，Aβ42)试剂盒购于elabscience；Nonidet P40试剂盒、转录因子EB(transcription factor EB，TFEB)抗体购于美国Santa。

1.4 主要仪器 Morris水迷宫：成都泰盟科技有限公司；mulISKANMK3型酶标仪：美国Thermo公司；HI650型离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；微量移液器：Eppendorf；电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；垂直电泳槽：北京六一仪器厂。

2 方法

2.1 分组及干预方法 20只APP/PS1小鼠，随机分为模型组、中药组，每组10只；另取10只同窝阴性小鼠作为对照组，中药组给予加减薯蓣丸按每日14 g/kg(根据有效大鼠剂量[3-4]换算)灌胃，每日1次，连续28 d；模型组和对照组予以等容积生理盐水灌胃。

2.2 观测指标及方法

2.2.1 Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力 灌胃28 d后，采用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力，正式测验前4 d开始获取训练：置于圆形水池，水下平台位于第3象限，小鼠从第4象限入水，实时摄像监测到达水下平台的时间(逃避潜伏期，90 s内)，超过90 s未找到则予以长杆引导至平台，停留15 s后移出。如此连续训练4 d，第5天撤去水下平台，进行探索试验。实时摄像记录时间段内探索轨迹，通过分析软件计算平台跨越次数、目标象限时间百分比。

2.2.2 酶联免疫吸附法检测海马组织中Aβ42水平 将海马组织在PBS中匀浆，然后用RIPA缓冲液进行匀浆。根据说明书，通过特异性酶联免疫吸附法试剂盒检测Aβ42的浓度。

2.2.3 Western blot检测海马组织中CTSB、P62、LAMP1、LC3、TFEB蛋白水平 根据最小动物样本量及获得统计学意义的实验结果所需达到最低生物学重复，通过SPSS 19.0软件计算，取其中6只进行蛋白水平检测。小鼠腹腔麻醉后直接断头取脑，冰上迅速分离双侧海马用于组织总蛋白提取，将新鲜海马组织剪碎，冰上研磨，加入组织裂解液后静置30 min、4 ℃离心后取上清，加入上样缓冲液裂解变性备用；同时根据文献[5]提取核内蛋白：将新鲜海马组织剪碎，冰上研磨，冰浴、离心后取下层沉淀物，对沉淀物重新进行重悬，加入100～200 μL含Nonidet P40缓冲液，冰浴10 min，4 ℃离心，吸尽上清液后的沉淀部分是细胞核，再次加入50～100 μL普通缓冲液，4 ℃离心，所获上清液即为细胞核蛋白。

每孔蛋白上样量30 μg，电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭2 h；按不同浓度(CTSB、P62浓度为1∶1 000，LAMP1、LC3浓度为1∶2 000，TFEB浓度为1∶250)稀释一抗抗体，4 ℃过夜；1倍TBST液洗3次，每次5 min；二抗(1∶10 000)室温摇床1 h；1倍TBST液洗3次，每次10 min；ECL发光液使条带可视化。Image J 1.41软件测量条带灰度值。

3 结果

3.1 各组小鼠学习记忆能力比较 水迷宫定位航行第1～4天，每组小鼠逃避潜伏期逐渐缩短。在第4天的实验中，与对照组相比，模型组小鼠逃避潜伏期延长(P<0.05)；与模型组相比，中药组小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05)。空间探索实验显示，与对照组相比，模型组小鼠穿越平台次数及在原平台象限停留时间占比均显著减少(P<0.05)；与模型组相比，中药组小鼠穿越平台次数及在原平台象限停留时间占比明显增多(P<0.05)。见图1、图2。

图1 各组小鼠游泳轨迹图

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 各组小鼠海马组织Aβ42含量比较 模型组小鼠海马组织中Aβ42含量显著高于对照组[(0.428±0.018)vs(0.208±0.013),P<0.05]；中药组小鼠海马组织中Aβ42含量为(0.277±0.014)，显著低于模型组(P<0.05)。

3.3 各组小鼠海马组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、LAMP1、CTSB蛋白表达水平比较 与对照组相比，模型组小鼠海马组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高，P62蛋白表达水平显著上调(P<0.05)，LAMP1、CTSB蛋白表达水平显著下调(P<0.05)；与模型组比较，中药组小鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值无明显变化(P>0.05)，LAMP1、CTSB蛋白表达水平显著上调(P<0.05)，P62蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。见图3、图4。

图3 Western blot检测各组小鼠海马组织CTSB、P62、LAMP1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表达水平

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.4 各组小鼠海马组织细胞核内TFEB表达水平比较 与对照组相比，模型组小鼠海马组织细胞核内TFEB和总TFEB表达水平均显著上调(P<0.05)；与模型组相比，中药组海马组织细胞核内TFEB表达水平显著上调(P<0.05)，总TFEB表达水平无明显变化(P>0.05)。见图5、图6。

图5 Western blot检测各组小鼠海马组织细胞核内TFEB及总TFEB表达水平

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

加减薯蓣丸源于汉代张仲景《金匮要略》中的薯蓣丸，由已故名老中医吕继端教授去其祛风之药，取其补中之效，同时加用补肾填精、化痰开窍药物以切合痴呆脾肾亏虚、痰瘀互结的病机化裁形成。在对小鼠行为学观察实验中，给予加减薯蓣丸干预4周后，小鼠的逃避潜伏期及穿越平台次数均有不同程度改善，提示加减薯蓣丸可以改善APP/PS1模型的小鼠学习记忆能力。

Aβ的生成和清除失衡被认为是AD的核心病理改变，Aβ在脑内的聚集可以引发神经细胞缺失和认知功能损害[1]。自噬作为真核细胞重要的分解代谢过程，越来越多的研究显示自噬在Aβ的产生和降解过程中起着重要作用，自噬功能异常可能是AD的发病机制之一[6]。自噬体形成后与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，以有效清除螯合的内容物，这一过程即自噬-溶酶体途径(autophagy lysosome pathway，ALP)。在AD中，ALP途径呈进行性下降[7]，蛋白质降解受损，同时神经突起存在自噬体和溶酶体内细胞器的累积[8]。在受损神经轴突中，β-分泌酶水平升高，斑块形成增多[9]。自噬溶酶体功能障碍同时会引起内吞淀粉样前体蛋白囊泡的转运时间延长，增加被β-分泌酶和γ-分泌酶切割倾向，导致Aβ生成增加[10-11]。在本实验中，模型组海马Aβ42水平较对照组增加，同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，提示脑内错误折叠蛋白Aβ引起保护性自噬水平增加，但LC3Ⅱ水平升高同时可能是溶酶体功能障碍，下游清除功能受损的结果[12]；经加减薯蓣丸干预后，海马区Aβ42水平下降，中药组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有增加，但与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)，表明加减薯蓣丸可能通过促进下游溶酶体降解，增加Aβ清除并减少LC3Ⅱ堆积。P62作为自噬底物转运蛋白，将泛素化蛋白质转运至自噬体并被溶酶体降解，当自噬功能缺陷时，P62在细胞质中不断累积[13]，与对照组相比，模型组P62水平明显增加，表明6月龄(5月龄老鼠经干预治疗后月龄为6)APP/PS1小鼠开始出现溶酶体功能障碍，经加减薯蓣丸干预后，中药组P62蛋白累积得以部分缓解。CTSB是溶酶体主要的天冬酰胺蛋白酶，反映溶酶体降解功能，LAMP1可以直接反映自噬体和溶酶体的成熟度，经加减薯蓣丸干预后，中药组LAMP1、CTSB水平增加，结合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白水平也进一步证明小鼠海马区自噬溶酶体功能得以改善。

目前已有文献表明，TFEB是ALP的主要调节因子，可以增加自噬和溶酶体基因的表达，刺激自噬体-溶酶体融合和自噬体内容物的降解[14]。TFEB动态调节ALP，增加TFEB表达是一种较高效率诱导自噬清除的途径[15]。TFEB活性是通过磷酸化调节，TFEB磷酸化使其与伴侣蛋白14-3-3的结合并保持在细胞质中无法发挥作用，而去磷酸化的TFEB/14-3-3复合物解离使TFEB转运至细胞核发挥转录激活靶基因的作用[16]。在AD模型中，增加TFEB的核内聚集可以加速淀粉样蛋白前体蛋白在溶酶体中的降解，从而减少Aβ的产生和淀粉样蛋白斑块的沉积[11，17]。本实验中，与模型组相比，中药组核内TFEB明显增加，表明加减薯蓣丸增加TFEB核内移位，增加自噬溶酶体途径清除错误折叠蛋白能力，减少海马区Aβ水平。

加减薯蓣丸方中山药、熟地黄、制何首乌、杜仲、枸杞子、五味子滋补肝肾、填精益髓；党参、白术、茯苓健脾益气；石菖蒲、远志化痰开窍益智；白芍、当归、川芎活血祛瘀。全方共奏健脾补肾、化痰祛瘀、开窍益智之效。自噬与中医痰瘀概念相似，衰老细胞器、错误折叠蛋白属于中医内生痰瘀之邪，痰瘀产生与自噬溶酶体功能障碍密切相关，有研究表明，多种活血化瘀药物可以起到调节自噬的作用[18]。组方中远志、石菖蒲、芍药等药物有效成分可从不同角度增强自噬途径，减少Aβ沉积[19]。综上所述，加减薯蓣丸通过促进TFEB核转移增强自噬溶酶体途径，减少海马区Aβ42水平，改善APP/PS1模型小鼠学习记忆能力。但AD发病机制复杂，而加减薯蓣丸可能还存在更多的作用靶点和影响机制，值得进一步深入研究。