25-羟基胆固醇对大鼠关节软骨细胞的影响及其机制

罗瀚文，何航元，袁明武，张 明,乐国平

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是指各种因素所导致关节软骨发生原发性或继发性退行性改变以及骨质增生，并伴有不同程度滑膜炎症。随着我国人口老龄化的加快，OA的发病率也出现逐年增加的势头，并且已成为危害中老年人健康及生活的主要原因之一。大规模流行病学调查发现，OA发病率在65岁以上老年人中高达33.6%[1]。传统观点认为OA属于老年退行性关节病变，其致病因素主要与年龄、性别、创伤等因素有关[2]。近年越来越多的学者提出，OA与全身代谢紊乱有关，甚至提出OA可能属于代谢综合征的范畴[3]。有研究发现，OA与心脑血管疾病存在十分紧密的联系，其发生与血胆固醇水平存在显著的相关性[4-6]。有学者发现，OA患者的软骨细胞内存在胆固醇蓄积，从而抑制软骨细胞外基质的合成与分泌，降低关节软骨的质量[7-8]。虽然已知胆固醇在OA的发生发展中有着重要作用，但目前关于胆固醇对OA的作用机制仍不明了。因此，本研究拟通过OA大鼠软骨细胞模型，检测不同浓度25-羟基胆固醇对软骨细胞基质合成及降解、胆固醇流出通路相关基因的mRNA表达的影响，探讨胆固醇在OA发生过程中对软骨细胞的作用机制，为阐明OA的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；青霉素、链霉素粉末(美国Sigma公司)；鼠白介素-1β(IL-1β，美国PEPRO TECH公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒(日本 Takara 公司)；逆转录试剂盒(杭州主诺生物技术有限公司)；乙醇、异丙醇、三氯甲烷(上海浩然生物科技有限公司)；组织总胆固醇(total cholesterol， TCH)测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；引物合成(上海生工公司)；其余试剂为分析纯。

1.2大鼠关节软骨细胞培养和分组 健康SPF级Wistar大鼠(180～220 g)购于湖北省疾病预防控制中心。在超净台内无菌操作获得大鼠膝关节软骨标本，在37℃水浴中用0.2% Ⅱ型胶原酶消化关节软骨标本至絮状。加入全培养液并重新悬浮以得到软骨细胞悬液。将细胞接种于培养瓶内，待细胞基本长满后传代培养。调整P3代细胞浓度为1×105/ml，接种于六孔板内用于进一步实验。接种24 h后撤掉血清，将培养孔分为对照组(正常软骨细胞不予任何处理)，模型组(用20 ng/ml IL-1β处理48 h制备OA模型)，5、25、125 μmol/L 25-羟基胆固醇处理组(先用各剂量25-羟基胆固醇处理24 h后，加入20 ng/ml IL-1β共处理48 h)。每组设5个复孔。

1.3软骨细胞mRNA表达的检测

1.3.1细胞总RNA提取:向六孔板各孔中加入1 ml trizol，转移至EP管中，加入200 ml氯仿，振荡15 s，冰上静置10 min。4℃离心(16 113×g，15 min)，取上清。然后加入与上清体积相等的异丙醇，混匀，静置10 min。4℃离心(16 113×g，10 min)，弃上清。加入1 ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心(11 190×g，5 min)，弃上清。晾干，加入30 ml双蒸水溶解。60℃促溶15 min。在测定A260/A280值后，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。

1.3.2RT-PCR反应：引物设计见表1。PCR反应体系为20 ml，采用ΔΔCt法分析结果。

表1 RT-PCR引物序列及退火温度

注：ABCA1为ATP结合盒转运蛋白A1，ABCG1为ATP结合盒转运蛋白G1，Aggrecan为蛋白聚糖，Col2a1为Ⅱ型胶原前体α1，LXRα为肝脏X受体α，MMP-13为基质金属蛋白酶-13

1.3.3软骨细胞TCH含量：采用组织TCH含量酶学检测试剂盒检测。通过消化和离心收集细胞，并将0.2 ml裂解液加入各孔中，混匀后室温下静置10 min。匀浆液离心(2000×g，5 min),取200 μl上清，加入玻璃试管，再加入测定试剂均匀混合，在37℃条件下孵育20 min。测定时先用蒸馏水管为空白管校零，随后即可测定各样本OD 500吸光度值，并根据试剂盒内标准品浓度计算各样本浓度。

2 结果

2.1大鼠关节软骨细胞基质合成及降解功能 在IL-1β诱导OA模型方面，首先检测了软骨细胞Ⅱ型胶原前体α1(α1 of collagen typeⅡ， Col2a1)、蛋白聚糖(Aggrecan)和基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase 13， MMP-13)的mRNA表达变化。与对照组相比，模型组5、25、125 μmol/L组Col2a1和Aggrecan的mRNA表达均显著降低，而MMP-13的mRNA表达则显著升高(P<0.05)。与模型组比较，仅125 μmol/L组Col2a1和Aggrecan的mRNA表达显著降低，MMP-13的mRNA表达显著升高(P<0.05)。见图1。

图1 25-羟基胆固醇对大鼠关节软骨细胞基质合成及降解功能的影响

对照组为正常细胞不予处理，模型组为用20 ng/ml IL-1β处理48 h制备骨关节炎模型，5、25、125 μmol/L组分别给予不同浓度25-羟基胆固醇处理；IL-1β为白介素-1β；Col2a1为Ⅱ型胶原前体α1，Aggrecan为蛋白聚糖，MMP-13为基质金属蛋白酶-13；与对照组比较，aP<0.05;与模型组比较，cP<0.05

2.2对大鼠关节软骨细胞胆固醇流出通路的影响 在此模型上，进一步检测了软骨细胞胆固醇流出通路肝脏X受体α(liver X receptor α， LXRα)、ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1， ABCA1)和ABCG1的mRNA表达变化。与对照组比较，模型组及25、125 μmol/L组LXRα的mRNA表达显著降低(P<0.05)，而模型组及5、25 μmol/L组ABCA1和ABCG1的mRNA表达则无明显改变(P>0.05)。与模型组比较，125 μmol/L组LXRα、ABCA1和ABCG1的mRNA表达均显著降低(P<0.05)。见图2。

图2 25-羟基胆固醇对大鼠关节软骨细胞胆固醇流出通路的影响

对照组为正常细胞不予处理，模型组用20 ng/ml IL-1β处理48 h制备骨关节炎模型，5、25、125 μmol/L组分别给予不同浓度25-羟基胆固醇处理；IL-1β为白介素-1β；LXRα为肝脏X受体α，ABCA1和ABCG1为ATP结合盒转运蛋白A1和G1；与对照组比较，aP<0.05;与模型组比较，cP<0.05

2.3对大鼠关节软骨细胞TCH含量的影响 与对照组比较，模型组大鼠关节软骨细胞TCH含量无明显变化(P>0.05)；当给予125 μmol/L 25-羟基胆固醇后，软骨细胞TCH含量较对照组显著增加(P<0.05)。见图3。

3 讨论

越来越多的学者开始认为OA的发病可能是源于全身代谢异常，而不是仅仅因为关节局部的病理改变所致。尤其是脂代谢紊乱与OA的发生存在着密不可分的关系[9-10]。有学者发现，家族性高胆固醇血症患者发生手部OA风险明显增加，其患者关节内可见明显的胆固醇沉积[11]。虽然胆固醇对细胞的活性及功能是一种不可缺少的物质，但细胞内胆固醇的大量蓄积将会对细胞产生损伤。研究发现，软骨细胞内胆固醇蓄积导致的损伤，必将影响软骨细胞基质的合成与分泌，从而导致关节软骨质量的降低[7]。已知细胞内胆固醇沉积可通过与脂肪酰基的作用，影响细胞膜流动性，并破坏细胞膜结构和功能，甚至导致细胞凋亡[12]。正常情况下，胆固醇是软骨细胞所必需的营养成分，但是在某些病理情况下软骨细胞内胆固醇的异常蓄积可导致OA发生[13]。Tsezou等[8]通过细胞实验发现，OA患者软骨细胞内脂质含量较正常人软骨细胞显著升高。另一项研究发现，在给予25-羟基胆固醇后，正常成人软骨细胞Col2a1的mRNA表达降低[7]。本研究进一步发现，给予125 μmol/L 25-羟基胆固醇可导致OA软骨细胞Col2a1和Aggrecan的mRNA表达减低，且MMP-13的mRNA表达升高，且TCH含量明显增加。提示胆固醇蓄积可影响软骨细胞的基质合成和降解功能，从而导致软骨质量降低。

图3 25-羟基胆固醇对大鼠关节软骨细胞TCH含量的影响

对照组为正常细胞不予处理，模型组用20 ng/ml IL-1β处理48 h制备骨关节炎模型，125 μmol/L组给予25-羟基胆固醇处理；IL-1β为白介素-1β；TCH为总胆固醇；与对照组比较，aP<0.05

由于胞内胆固醇的蓄积可导致细胞功能损伤，所以大部分细胞都有着严格的胆固醇流入、流出系统，以防止胞内胆固醇蓄积[14]。在外周组织，细胞内的胆固醇主要依靠跨膜整合蛋白ABCA1或ABCG1转运至胞外，而后通过血液循环转移至肝脏，该过程受到LXR等多种因子调节[15-16]。有研究发现，OA软骨细胞存在细胞内脂质沉积，同时细胞胆固醇流出系统相关基因ApoA1及LXR表达降低，且LXR激动剂TO-901317可显著性增强ApoA1和ABCA1基因表达，明显促进软骨细胞内胆固醇流出和改善细胞内脂质沉积[8,17]。因此，胆固醇流出系统的改变可能是导致OA发生的因素之一，而LXR在软骨细胞胆固醇流出系统中扮演着重要角色。但目前仍未有直接证据报道，高胆固醇血症是否可通过抑制软骨胆固醇流出通路，从而进一步加重软骨胆固醇蓄积。我们的结果显示，125 μmol/L 25-羟基胆固醇可导致大鼠OA软骨细胞胆固醇流出通路相关基因LXRα、ABCA1和ABCG1的mRNA表达显著降低。提示胆固醇可能通过抑制软骨细胞LXRα/ABCA1/ABCG1通路，影响软骨细胞胆固醇流出系统，从而进一步导致软骨细胞内胆固醇蓄积。流行病学资料表明，他汀类降脂药物可有效改善膝关节OA的发生与进展[18]。这可能与其通过改善软骨局部胆固醇蓄积有关。

综上所述，胆固醇在OA的发生、发展中占有重要地位，其可能通过抑制软骨细胞胆固醇流出通路，进而导致软骨细胞内胆固醇蓄积，最终引起软骨细胞质量降低，加重OA发展进程。本研究有助于我们全面认识胆固醇代谢与OA二者之间的关系，对OA的早期预防和治疗方案的选择起到了指导作用。