大鼠挤压伤解压后各时间点蛋白质组学差异

吴 超，张 赛，张椿钰，王 恺，程 明

挤压伤(crush injury, CI)是肢体肌肉丰厚部位受到重物挤压造成的损伤，严重者可引起全身多器官损伤，称为挤压综合征(crush syndrome, CS)[1-2],尤以肾为最常见且最严重，常导致急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)，甚至急性肾衰竭(acute renal failure, ARF)，病死率极高[3-5]。随着工业生产、交通工具等的自动化程度增高，人为损伤逐渐增多，加之自然灾害防范困难，CI的数量并未减少，甚至有增加的趋势[6]。近些年，关于CI的研究并未有明显进展，当前挤压伤的致伤机制主要集中在缺血再灌注损伤及由缺血再灌注引起的横纹肌溶解[7]。关于其分子机制等的研究较少。临床上CI一般都有明确的外伤史，且多数肢体有挤压留下的压迹，CI患者在解压后短时间内即可出现肌红蛋白尿，实验室检查如血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)、血钾、血清肌红蛋白含量等均对CI的诊断有一定帮助。关于CI严重程度及预后的判断，尚无明确临床指标。本研究旨在通过应用蛋白质组学方法，对CI大鼠模型血清进行检测，筛选出其中与CI关系密切的生物大分子，以期通过观察不同时间浓度的差异，提示CI的病程进展及预后，筛选分子靶点，为CI的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 由美国Water公司提供的高效液相色谱仪，串联质谱仪由赛默飞公司提供。iTRAQ相关试剂主要由美国应用生物系统公司、赛默飞公司及西格玛公司提供。

1.2实验动物分组及模型制备 选取APF级清洁雄性Wistar大鼠40只(由中国人民解放军军事医学科学院提供)，体重200～240 g，正常食水适应性喂养1周。将大鼠随机分为对照组(C组)、0 h组(Z组)、12 h组(T组)、72 h组(S组)，每组10只。按照100 g体重0.3 ml 2%戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉后将大鼠置于武警救援医学研究所自主研发的实验动物挤压平台，对双后肢进行挤压，设定挤压时间为16 h，挤压压力为3 kg。挤压完成后将Z组与C组立即用戊巴比妥钠麻醉并进行取材，其余组每只大鼠单独分笼喂养进行观察，给予正常食水。观察时间结束时用戊巴比妥钠麻醉并取材。

1.3样品获取及检测 将大鼠麻醉后固定于鼠板开腹，取腹主动脉血约2 ml置于促凝管，轻轻混匀后冰上放置30 min，4℃、1200×g离心15 min，分离血清置于0.5 ml EP管。用BCA定量法进行蛋白定量。调整蛋白浓度后取100 μg样品按顺序进行SDS-PAGE电泳、还原烷基化和酶解、iTRAQ标记、C18反向柱分离、质谱分析。

1.4统计学方法 将收集到的数据使用UniProt-Rattus norvegicus数据库进行搜索。查库时将raw文件提交至Proteome Discoverer服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。使用R语言中的t.test函数检验样本间差异显著性P值，依据鉴定的蛋白丰度，蛋白间无显著差异时蛋白丰度比值为1，当丰度比达到1.2倍以上(不包括1.2倍)，且经检验P<0.05，即视为差异蛋白。

2 结果

2.1差异蛋白鉴定结果 本次试验共鉴定出568个蛋白，其Z/C得到符合条件的差异蛋白206个，其中上调蛋白133个，下调蛋白73个；T/C得到357个差异蛋白，其中84个蛋白上调，273个蛋白下调；S/C得到280个差异蛋白，其中上调蛋白82个，下调蛋白198个。将各组结果进行汇总筛选出变化趋势相同的蛋白，共得到110个共同差异蛋白。剔除变化<1.5倍(包括1.5倍)的蛋白，得到上调蛋白18个，下调蛋白11个，其中包含4个未知蛋白(Uncharacterized protein)。见表1。

2.2差异蛋白表达情况

2.2.1总体表达趋势：通过汇总各观察时间点的蛋白表达趋势曲线,得到总蛋白在各时间点的总体表达趋势。挤压伤解压后差异蛋白总体呈现出先急剧变化而后逐渐回归的趋势，且在各观察时间点，无论表达上调或下调，挤压后12 h均为变化最明显的时间点。见图1。

2.2.2不同时间差异蛋白表达情况：上调蛋白中腺苷酸琥珀酸合成酶同工酶1、丝氨酸蛋白酶抑制剂a3n、磷酸甘油酸变位酶2、α1-酸性糖蛋白、结合珠蛋白、α2巨球蛋白、纤维连接蛋白、果糖二磷酸醛缩酶A、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、犁鼻2受体46与总体趋势一致，且腺苷酸琥珀酸合成酶同工酶1上调最明显。见图2。下调蛋白中Igγ-2C链C区、盘状蛋白，CUB和LCCL结构域蛋白2、皮质类固醇结合球蛋白、富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域3、维生素E结合糖蛋白与下调蛋白总体趋势一致。见图3。RCG49849、血清白蛋白表达在各时间点表达较稳定。

2.3差异蛋白相互作用 共同差异蛋白STRING网络相互作用结果显示，Pkm(Pyruvate kinase PKM)、Pgam2(Phosphoglycerate mutase 2)、Aldoa(Fructose-bisphosphate aldolase A)、Pygm(Alpha-1,4 glucan phosphorylase)、Serpina3n(Serine protease inhibitor A3N)、Hp(Haptoglobin)、A2m(Alpha-2-macroglobulin)、Fgg(Fibrinogen gamma chain)、Fn1(Fibronectin)、Lcn2(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)、Adssl1(Adenylosuccinate synthetase isozyme 1)、Pvalb(Parvalbumin alpha)、Serpina6(Corticosteroid-binding globulin)、Afm(Afamin )处于关键节点，可能与CI的发病机制及病理进程有关。见图4。

2.4差异蛋白KEGG通路富集结果 糖酵解/糖异生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、胰高血糖素信号通路(Glucagon signaling pathway)、碳代谢(Carbon metabolism)、癌症中的中枢碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)均为与糖代谢有关的通路。见表2。表明CI解压后不同时间机体糖代谢与疾病进程相关。

表1 筛选出的29个差异蛋白编号及对应名称

图1 4组差异蛋白总体表达趋势
C组为对照组，Z组为挤压后0 h组，T组为挤压后12 h组，S组为挤压后72 h组

图2 4组各上调差异蛋白表达情况
C组为对照组，Z组为挤压后0 h组，T组为挤压后12 h组，S组为挤压后72 h组

图3 4组各下调差异蛋白不同观察时间表达情况
C组为对照组，Z组为挤压后0 h组，T组为挤压后12 h组，S组为挤压后72 h组

图4 共同差异蛋白STRING相互作用网络图

表2 差异蛋白KEGG通路富集结果

3 讨论

本研究结果显示，差异蛋白在解压后12 h达到高峰。分析原因可能与解压后大量富氧血液流入受压组织，导致组织再灌注损伤，造成更进一步的组织损伤有关。未解压时，局部组织缺血、缺氧，导致代谢紊乱，细胞内ATP大量消耗，机体局部组织依靠有氧氧化供能无法提供充足的能量，此时激活糖代谢其他途径如糖酵解/糖异生等以满足机体能量需求。当压力解除后，富含氧的血液涌入受损组织，然而组织功能严重受损导致无法很好地利用氧，从而产生大量活性氧对组织进一步损伤，在短时间内造成病情恶化[8]。

本研究结果显示，肌酸激酶(creatine kinase，CK)在解压即刻处于高水平，随着解压时间延长而降低。既往研究报道，CK作为判断CI严重程度的指标之一[9]，但也有文献提出，其不能作为判断疾病严重程度的指标[10]。CK以骨骼肌和心肌含量最多，其次为脑、平滑肌和肝脏等，其主要存在于细胞质和线粒体中，与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP再生直接相关，常用于肌病的检测。正常状态下由于酶蛋白分子直径远大于肌细胞膜孔径，因此很少从细胞膜透出。病理状态下血清CK水平升高,一般提示含有CK的组织细胞通透性增强或细胞破坏,尤其是骨骼肌纤维的膜通透性异常或肌纤维损伤。骨骼肌损伤、进行性肌营养不良、多发性肌炎和全身性惊厥时主要以肌型肌酸激酶同工酶(CK-MM)为主，脑血管意外、脑部手术、严重平滑肌损伤如肠梗阻可见脑型肌酸激酶同工酶(CK-BB)增高。国内学者的研究显示骨骼肌损伤后血清CK含量明显增加，且与损伤的严重程度相关[11-12]。CI局部肌肉组织缺血缺氧，引起创伤性横纹肌溶解，肌细胞崩解、纤维断裂，大量肌细胞内物质释放，再灌注发生时，随血液进入循环，引起血清CK水平增高，与前期研究结果相一致。

实验结果显示，14-3-3蛋白ε在各时间点表达水平增高，随着观察时间延长其表达水平逐渐回落。14-3-3蛋白家族是一类广泛存在于真核生物细胞胞浆、线粒体、高尔基体等细胞器中的酸性小分子蛋白。有研究表明，14-3-3蛋白通过与靶蛋白结合，影响靶蛋白结构、蛋白活性或稳定性、改变蛋白在细胞中的分布来发挥作用，参与调控如细胞信号转导、凋亡、细胞周期、细胞代谢等多种生理活动[13-14]。在诸多疾病如关节炎、恶性肿瘤、感染性疾病等多种疾病中发挥重要作用[14-17]。14-3-3蛋白还可与糖代谢、脂肪酸代谢、核酸代谢、鸟氨酸代谢及还原代谢中的关键酶结合，并且14-3-3蛋白可以与Akt磷酸化的PEK-2结合使PEK-2在糖酵解途径保持激活状态[16]。本研究中14-3-3蛋白ε表达水平增高，推测其可能通过：①维持糖酵解途径激活状态，为局部能量代谢障碍组织提供能量；②调节细胞凋亡，使受损组织加速破坏这两种生物过程调节该疾病的病理进程。本实验中14-3-3蛋白ε的表达趋势与CK相似，根据实验结果CK与14-3-3蛋白ε有判断挤压解压时间的特性，可用于判断疾病进程，为治疗方案的建立提供参考，这仍需进行后续研究证实。

血清白蛋白由肝脏合成，具有维持血浆渗透压、物质转运、解毒及维持胶体稳定性等功能，既往研究指出血清白蛋白通过捕获氧自由基、结合氧化活性产物等减轻机体损伤[18]，输入人血清白蛋白可以改善未复苏的内毒素血症大鼠的微血管灌注[19]。有研究显示，缺血后血清白蛋白含量及其钴结合能力下降[20-21]。本实验结果显示，挤压解压后不同时间血清白蛋白水平降低,且表达水平相对较稳定，分析原因可能为由于CI发生后，机体肝脏直接或间接受到损伤，白蛋白合成减少，加之毛细血管通透性增强，蛋白局部渗出至组织间隙，导致白蛋白含量降低。解压后发生缺血再灌注，同时缺血导致氧自由基大量释放，进而导致血清白蛋白含量持续降低。在CI发生时，受挤压个体往往营养供应不足，导致白蛋白合成受阻，也可能是导致其降低的原因。因此，在CI发生过程中血清白蛋白含量的变化，可能在疾病进展方面有一定参考价值。

血浆维生素E结合蛋白在解压即刻表达水平降低并持续到12 h达到低值，72 h逐渐回升。血浆维生素E结合蛋白是一种由肝脏分泌的糖蛋白，具有维生素E特异性结合特性。既往研究显示该糖蛋白参与炎症和免疫反应[22]。因血浆维生素E结合蛋白、甲胎蛋白以及维生素D结合蛋白与血清白蛋白序列同源,故将其归为血清白蛋白家族。血浆维生素E结合蛋白具有神经保护活性，在细胞凋亡条件下和维生素E可协同增强皮质神经元的存活。此外，血浆维生素E结合蛋白本身也有保护皮质神经元的作用[23]。研究表明，血浆维生素E结合蛋白与冠心病的发生发展关系密切[24]。剔除血浆维生素E结合蛋白基因可提高胰岛素的敏感性[25]。此外血浆维生素E结合蛋白与多囊卵巢综合征患者炎症调节过程及颅内动脉瘤形成相关[26-27]。本实验结果显示，血浆维生素E结合蛋白在CI各组中显著下调，在12 h达到低值，我们推测其水平降低与局部肌肉等软组织损伤有关，组织细胞坏死，消耗大量血浆维生素E结合蛋白，导致其血清水平快速下降。随着解压时间延长，组织再灌注，组织破坏加剧，血浆维生素E结合蛋白消耗进一步增加，血清含量进一步降低，当度过这一时期，机体调节功能恢复，其浓度会出现回升。

从差异蛋白KEGG通路富集结果中我们得到糖代谢相关路径在CI发生发展中起重要作用。糖代谢途径是机体三大营养物质代谢的共同途径，通过糖代谢途径将营养物质转化为能量供代谢消耗。受到创伤打击时，机体发生应激，能量消耗增大，需氧量增加，加之局部能量消耗急剧增加，机体能量代谢处于相对紊乱的状态。此时糖代谢的相关途径尤其是糖酵解途径增强，产生更多能量。通过糖异生途径，补充能量生成所需糖。根据富集结果Aldoa、Pgam2、Pkm在CI中参与各代谢途径，且均为糖酵解关键酶。Aldoa在肿瘤细胞中表达增高[28-30]。Pgam2广泛存在于体内多种组织，文献显示其与心肌梗死、脑卒中等疾病相关[31]。Pkm是糖酵解的限速酶，有研究结果显示，Pkm在恶性肿瘤中表达升高[32-33]。

本实验通过对CI大鼠血清进行蛋白质组学分析发现，糖酵解对CI的进展有重要意义，相关糖代谢酶类Aldoa、Pgam2、Pkm及14-3-3蛋白ε、血浆维生素E结合蛋白可能对判断疾病进程有一定参考价值，CK作为既往血液指标与疾病进程相关。血清白蛋白可能在治疗CI中有一定作用，尚需进一步验证。后续仍需扩大样本量并对结果进行临床验证。