lncRNA在乙型肝炎病毒复制调控中的研究进展*

邓慧敏，张 琰，宋春丽 综述，周义文 审校

南方医科大学深圳医院临床检验医学中心，广东深圳 518000

全世界有超过2.4亿人感染乙型肝炎病毒(HBV)，15%～40%的未接受治疗的慢性HBV感染者可进展为肝硬化，最终导致肝衰竭和肝癌[1-2]。HBV是大小约为3.2 kb的部分环状双链DNA，其在DNA聚合酶作用下可转化形成共价闭合环状DNA(cccDNA)。肝细胞中的两个高活性启动子EnhancerⅠ(En1)、 EnhancerⅡ(En2)与肝细胞表面表达的特异性受体蛋白及细胞内富集的各类转录调控因子共同决定了HBV的嗜肝特性[3]。想通过药物彻底消灭慢性HBV携带者体内的全部病毒十分困难，因此，寻找新的HBV检测标志物长链非编码RNA(lncRNA)在早期诊断HBV感染及调控HBV的复制过程有着重要的意义。

近十年的研究结果支持将大于200个核苷酸的非编码RNA(ncRNA)称为lncRNA，其占ncRNA总量的80%以上，多由RNA聚合酶Ⅱ转录形成。根据lncRNAs与临近蛋白编码基因的结构关系，分为以下5类：(1)正义链或反义链；(2)双向的lncRNAs；(3)基因间的lncRNAs；(4)增强子lncRNAs；(5)内含子lncRNAs[4-5]。根据lncRNAs保守性差，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程的特点，推测对于感染HBV的细胞，靶向治疗的关键点就是对基因转录、蛋白质翻译以及细胞核内核外信使进行干扰[6]。因此，本文就lncRNAs的功能及其参与HBV复制的具体分子机制综述如下：全面深入了解HBV复制相关的lncRNA肝癌高表达转录本(HULC)、lncRNA HOX转录反义RNA(HOTAIR)、乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)相关的lncRNA DBH-AS1、lncRNA生长阻滞特异性转录本5(GAS5)、lncRNA母系印记基因3(MEG3)等对HBV复制的调控机制，进一步认识HBV持续感染的过程，发现抗HBV复制的新靶点。

1 高表达lncRNAs

1.1lncRNA HULC HULC定位于染色体6p24.3。因为HULC没有开放阅读框，故不参与相关蛋白质的翻译[7]。HBX的转录活性是病毒复制的必要条件，HBX的转录本在肝细胞中逐渐累积，可诱导、改变许多参与基因表达需要的信号转导途径，控制细胞周期，参与转录调节、免疫应答和代谢等。cAMP反应元件结合蛋白(CREB)是HULC核心启动子区域53nt-67nt位的一个结合位点，HBX可直接结合CREB上调HULC活性，抑制p18的表达水平，干扰ATM/ATR和p53信号传导途径，反式激活、增强HBV在细胞内的复制功能[8-9]。

miR-372是一种与细胞周期调控相关的微小RNA，通过介导转录因子与启动子解离，促使HULC表达降低[10]。HULC近端启动子区域内的CREB磷酸化后能够“打开”并维持HULC启动子局部染色质结构，其具有抑制一系列miRNA，包括miR-372活性的能力。HULC抑制miR-372导致其靶基因Prkacb的翻译减少，诱导CREB磷酸化，磷酸化后的CREB再次激活HULC活性，增强HULC与miR-372结合，如此循环往复，构成正反馈调节[11]。HBX与miR-372共同增强CREB转录因子的活性，使HULC在HBV感染患者体内明显增高，提示HULC的高表达可作为诊断HBV复制的血清学检测指标，抑制肝细胞内HBV的复制。

1.2lncRNA HOTAIR HOTAIR长度约为2 158 bp，定位于染色体12q13.13，在HOXC11与HOXC12之间。其基因包含5个短外显子与1个长外显子(235 bp的A和239 bp的B两个结构域)，HOTAIR结构保守性相对较高，尤其是B结构域更加保守。HOTAIR的功能部位主要集中在5′端的外显子1′和3′端的B结构域[12]。在HBV复制的细胞中发现有丝分裂polo样激酶1(Plk1)呈高表达，两种转录阻滞因子多梳蛋白SUZ12和ZNF198则低表达。此外，SUZ12是转录抑制复合物PRC2的重要亚基之一，ZNF198的稳定性由复合物(赖氨酸特异性脱甲基酶1)调节,并观察到Plk1位点特异性介导SUZ12和ZNF198的磷酸化，磷酸化抑制了SUZ12与PRC2的结合，破坏ZNF198与赖氨酸特异性脱甲基酶1复合物间的相互作用。HOTAIR通过交叉调节导致HOXD基因沉默和组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)，3′端则与组蛋白脱甲基化酶复合物(LSD1/RE1沉默转录因子、REST/REST共抑制蛋白、CoREST)相互作用使组蛋白H3第4位赖氨酸二甲基化(H3K4me2)。HOTAIR就这样作为一个支架与两个复合物结合，靶向目的基因使染色体重排导致基因沉默[13]。HOTAIR的表达增强了SUZ12和ZNF198的Plk1依赖性泛素化，也增加了Plk1介导的蛋白质降解，明显降低了SUZ12和ZNF198的稳定性[14-15]。HBV的复制刺激了HOTAIR与Plk1的表达，支持了该机制与HBV复制的相关性学说。

1.3lncRNA DBH-AS1 DBH-AS1是一个长度约为2 kb的lncRNA，是染色体9q34转录的多腺苷酸化尾巴。SUDAN等[16]通过微阵列分析发现槲皮素能够下调HepG2细胞中DBH-AS1的表达，HSIEH等[17]发现槲皮素能有效抑制HBX对几种关键癌基因的调控，推测HBX可能通过影响DBH-AS1的表达，参与HBV的复制。DBH-AS1可上调细胞周期正向调控蛋白CDK6、CCND1和CCNE1的mRNA水平，而下调细胞周期负向调控蛋白P16、P21、P27的mRNA水平，从分子水平验证了DBH-AS1具有促进细胞周期进程的作用。此外，通过过表达DBH-AS1可使p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白磷酸化水平增高，证明DBH-AS1具有活化MAPK通路的功能。MAPK信号传导通路活化后促进cyclinD在G1期的表达，通过形成cyclinD-CDK4/CDK6复合物，加速G1/S期和G2/M过渡期，使细胞越过G1期限制点，从而促进细胞周期进程。研究还发现，DBH-AS1基因上游有一个类似p53的结合位点跨越了-447～-461 bp位置，抑制P53蛋白的生成，升高DBH-AS1的表达，但p53是否通过直接与DBH-AS1的启动子区域结合仍需进一步研究[18]。P53蛋白负向调控细胞中DBH-AS1的含量，HBX与DBH-AS1的表达呈正相关。DBH-AS1上调MAPK信号通路中磷酸化的关键蛋白(p-ERK、p-p38、p-JNK)表达水平，加速细胞周期进程，抑制HBV DNA的核酸切除修复，促使负性生长调节因子失活，调控细胞凋亡等。

HBX是相对分子质量约为17×103的蛋白质，由HBVx基因编码的154个氨基酸构成。HBX在细胞核内有转录调控启动子活性和在细胞核外调节信号通路的双重功能。HBX并不直接结合HBV基因组，而是与细胞内重要转录调控因子结合，增强HBV启动子活性，促进HBV DNA的复制。DBH-AS1与HBX、p53之间的调节不仅影响细胞周期、转录和凋亡相关的信号通路，还促进病毒复制引起持续的免疫反应，促使HBV感染肝细胞引发慢性炎性反应。

2 低表达lncRNAs

2.1lncRNA GAS5 GAS5全长约为651 bp，定位于染色体1q25.1，于1988年在生长阻滞细胞中被发现。GAS5的编码基因是5′-末端寡嘧啶束(5′TOP)家族成员，包含12个外显子，内含子可编码10个box C/D snoRNA。KINO等[19]发现成熟的lncRNA GAS5在一系列物种中的生长阻滞期积累，在缺乏血清或缺少生长因子诱导的生长抑制状态下呈明显上调趋势。

目前研究发现，在HBV阳性患者的血清中GAS5检出率明显高于健康人，GAS5可能通过以下几种途径参与HBV DNA的复制：mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇激酶-相关激酶家族。这些激酶介导细胞对压力的反应，如DNA损伤和营养缺乏，该蛋白质作为FKBP12-雷帕霉素复合物细胞周期停滞和免疫抑制作用的靶标。LAPLANTE等[20]发现，5′TOP RNA GAS5通过影响雷帕霉素，减弱mTOR通路的特异性抑制细胞周期阻滞效应。HBV DNA大量复制时，由于p53与HBV增强子的特定区域结合，p53调控5′TOP RNA GAS5的表达受到抑制，GAS5通过影响雷帕霉素，减弱GAS5对生长停滞的保护效应，进一步促进HBV DNA的复制。

lncRNA GAS5具有细胞内天然“分子海绵”的作用，GAS5作为竞争性内源性RNA(ceRNA)吸附miR-21，使mRNA-21表达上调进而发挥相关生物学功能，影响HBV复制[21]。miR-123作用于HBV core mRNA，减少HBV核心蛋白表达量，下调HBV的复制[22]。GAS5启动子区存在CpG岛，启动子的高度甲基化使转录活性受到抑制，下调GAS5的表达，增强HBV DNA的复制，诱导HBV阳性者肝纤维化、肝细胞癌的发生，促使肿瘤的远处转移。

2.2lncRNA MEG3 MEG3转录长度约为1.6 kb，定位于染色体14q32.3的DLK1-MEG3印迹区域。通过MEG3基因内10个外显子可剪接产生16种不同变体，现已证实有16种人MEG3 cDNA同种型。其中，变体1(NR_002766)即为MEG3，是主要的转录本[23-24]。有研究报道，MEG3可以通过依赖p53的方式调节下游靶基因的表达[25-26]。P53蛋白共有3个主要的结构域，N-末端反式激活结构域(TAD)、中间序列特异性DNA结合结构域(DBD)和含寡聚化结构域的C-末端调节区(OD)。MEG3可以与P53蛋白的DBD直接结合，以依赖p53的方式使P53蛋白在细胞内积聚，延长P53蛋白半衰期,影响正常的细胞周期，还可通过抑制p53依赖的启动子转录和选择性地调节p53下游的靶基因GDF15的表达，使HBV DNA复制的负性调控作用减弱。MEG3也可以通过不依赖p53的方式，如通过募集一些蛋白复合体对p53下游靶基因发挥功能调节作用，干扰HBV DNA的复制。P53蛋白和HBV的结合方式有蛋白质-蛋白质结合(P53蛋白与HBX Ag的结合),DNA-蛋白质结合(HBV DNA与P53蛋白的结合)，研究发现积聚的P53蛋白与HBX Ag可进一步反式激活、增强HBV的复制[27]。

研究发现，许多白细胞介素(IL)家族成员，如IL-6、IL-8，IL-24，和IL1A的表达量在MEG3稳定高表达细胞中均显著增加，炎症因子IL-6在HBV感染早期可以通过调控HNF4a的表达来抑制HBV的复制，这也是炎症因子调控HBV复制的重要手段[28]。随着HBV复制，MEG表达量逐渐降低，IL家族抑制HBV复制的作用逐渐减弱，HBV利用宿主的特异性代谢活动来促进自身病毒的增殖。此外，基因的甲基化在细胞增殖、DNA修复、细胞周期调控和凋亡中起着重要作用[28]。MEG3的启动子区富含CpG岛，并且有两个差异性的甲基化区域(DMRs)IG-DMR和MEG3-DMR，均位于MEG3基因的上游。ZHANG等[29]认为MEG3启动子或基因间差异DMRs甲基化可能是导致细胞中MEG3低表达或表达缺失的主要原因，成为HBV复制失去抑制的又一重要原因。

3 其 他

除了如上所述众多的lncRNAs，还有许多其他因素也间接参与HBV的转录调控[30]。例如：雌激素可以通过雌激素受体(ER-a)抑制由HNF4a介导的病毒转录活性，进一步调控病毒基因表达和复制，这也能部分解释在HBV感染人群中女性比男性的HBV载量要低的原因。干扰素是宿主细胞应对病毒入侵的天然保护手段，HBV感染及复制时诱导的干扰素或者外源治疗使用的干扰素都可诱导大量的抗病毒基因的表达。炎症因子IL-6在HBV感染早期也可以通过调控HNF4a的表达来抑制HBV的复制。靶向干预HBX与肝细胞内DDB1-E3泛素连接酶结合，阻断HBX对smc5/6复合体等宿主限制因子的降解，增强对cccDNA的抑制作用，进一步影响HBV基因组的转录，干扰子代病毒的产生。此外，最新研究发现血清中存在抗体所包裹的乙型肝炎亚病毒颗粒，以衣壳-抗体复合物的形式存在，为HBV RNA的主要载体，因其对抗病毒药物的敏感性明显低于HBV DNA，考虑将其作为肝内cccDNA的替代标志物，为抗HBV治疗后疗效评估提供新的检测指标[31]。

4 总结与展望

随着对lncRNAs的关注，目前发现有多种lncRNAs广泛参与HBV复制的各个阶段，它们在慢性乙型肝炎患者体内频繁异常表达。本文以现有的文献为依据，总结了lncRNAs在HBV复制过程中周期调控、染色质重构、转录调节、翻译调控、增强子/启动子修饰、HBV嗜肝特性等方面内容，明确了HBV与P53蛋白的关系，既存在DNA-蛋白质(HBV DNA-P53蛋白)结合形式，也存在蛋白质-蛋白质(HBXAg-P53蛋白)结合形式，详细阐述了lncRNAs与HBV复制调控间的最新研究成果。进一步了解HBV复制调控网络及其与lncRNAs之间的相互作用,为发现更好的抗HBV治疗策略提供思路，为肝脏疾病的早期诊断和早期治疗提供新的生物标志物以及准确的药物作用靶点。