肺炎克雷伯菌外排泵基因研究与耐药性的关系*

诸宏伟，臧欢欢，刘培培，沈怀云，王 磊

蚌埠医学院第一附属医院儿科，安徽蚌埠 233004

细菌耐药已成为公共卫生问题，耐药菌感染是感染性疾病疗效欠佳、住院时间延长、患者死亡的重要原因。肺炎克雷伯菌是常见的病原菌，占医院感染的15%～20%，可引起各种肺外感染，包括泌尿系统感染、肠炎、脑膜炎、菌血症等[1]。近年来因抗菌药物滥用、不合理用药等原因，肺炎克雷伯菌耐药率呈逐年上升趋势，已成为“超级耐药”细菌，在全世界广泛传播，分离率仅次于大肠杆菌[2]。外排泵是细菌耐药的重要途径，进行外排泵基因分析，有助于分析细菌的耐药机制。本文尝试分析肺炎克雷伯菌外排泵基因与耐药性的关系，为细菌耐药管理提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 菌株来源于2016年1月至2018月12月在该院住院的儿科患儿，从粪便、痰液、血液、组织液等标本中分离获得，经全自动菌株鉴定药敏分析仪进行初筛，对看家基因GyrA、ParC进行基因扩增与测序，并对比鉴定，确定菌种，共获得菌株144株。仪器设备：KB药敏纸片，PCR引物，PCR反应试剂盒，序列测定，梯度PCR仪，D3024台式高速微量离心机，CHB-100恒温金属浴，JY-SPB电泳仪，全自动菌株鉴定药敏分析仪，凝胶成像系统，超净工作台恒温水浴锅，紫外透射仪等。材料：琼脂糖，MH培养基，DNA marker DL-2000，PCR反应用Eppendorf管，dNTP聚合酶。

1.2方法

1.2.1药敏分析 规范操作，挑选单个菌落，置入菌种保存管-80 ℃冰箱保存，需要检验时，复苏细菌，挑选冻存菌接种在MH血琼脂平板上，划线后37 ℃过夜静置培养。药敏试验采用KB纸片扩散法，质控菌株：肺炎克雷伯菌 ATCC700603，大肠埃希菌 ATCC25922。参照美国2015年临床和实验室诊断标准、WHONET5.6软件药敏数据分析，进行药敏性判断。药敏药物主要包括氨苄青霉素、氨苄舒巴坦、头孢唑林、头孢曲松、头孢他啶、氨曲南、头孢吡肟、环丙沙星、呋喃妥因、庆大霉素、复方磺胺甲噁唑、亚胺培南、美罗培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦。

1.2.2基因检测 基因提取：煮沸法提取NDA，将菌种接种到麦康凯平板上，放入孵箱内35 ℃过夜，分离培养得到单个细菌菌落，放入微量离心管装载。吸取200 μL无菌双蒸水放入微量离心管，以取菌环提取细胞的细菌菌落，放入离心管，均匀混合，密封离心管，将离心管放入100 ℃沸水煮沸100 min，将煮沸后的离心管放入离心机8 000 r/min离心30 s，取上清液置入另外一个微量离心管，-20 ℃保存，备用。

基因检测：(1)设计引物，外排泵基因包括oqxA(引物序列P1:CTC GGC GCG ATG ATG CT，P2:CCA CTC TTC ACG GGA GAC GA，产物392 bp)、oqxB(引物序列P1:TTC TCC CCC GGC GGG AAG TAC，P2:CTC GGC CA1 TTT GGC GCG TA，产物512 bp)、AcrAB-TolC(引物序列P1:ATG CAA AAT TAT TCG CTT TCA GGC，P2:GAT ACA CAC CGC CTC CTC AAA，产物420 bp)、qepA(引物序列P1:GCC GAA CGC CGC TGC CGA CAG，P2:TGC TGC TGA CGC TGG CGC TC，产物512 bp)、tehA(引物序列P1：ATA GCC CAC CGC TTT GCC，P2:CGT TAC GCC AGC ACC CTC T，产物301 bp)、emrD(引物序列P1:CCT GGC GTA GCG GAG ATG，P2:GGC CGT AGA ATA GCT GTG AAA T，产物378 bp)、qacE△l-sull(引物序列P1:TAG CGA GGG CTT TAC TAC TAA GC；P2:ATT CAG AAT GCC GAA CAC CG，产物300 bp)。(2)配置工作液，取出引物进行高速离心，根据引物标注的量向离心管加入无菌蒸馏水，震荡溶解，配置引物原液，-20 ℃冰箱保存，将配置好的引物原液按照1∶20比例稀释后离心。(3)检测基因，操作前计算反应体系量，将EP管放在冰盒上，做好标记。取EP管，计算反应体系中的各个试剂量顺序，加入EP管，加入T安全DNA聚合酶，瞬时离心，混合；吸取23 μL配置好的反应液，加入到每个小的EP管，每个EP管加入2 μL DNA 模板液，加入1滴石蜡油。反应完成后，8 000 r/min瞬时离心，放入DNA扩增仪扩增基因。(3)最后进行琼脂糖凝胶电泳，吸取1 μL上样缓冲液,4 μL的扩增产物混合，加入凝胶点样孔，第一个点样孔加入4 μL DNA标记，最后一个加入无菌水，作为阴性对照。电泳仪电压100 V，电泳40 min，然后用0.5 μg/L溴化乙锭染色，进行自动分析。

1.3观察指标 分析抗菌药物耐药情况、外排泵基因检出情况、耐药菌药物品种数与外排泵基因阳性个数的相关性等。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行统计学处理，计数资料以率表示，外排泵基因阳性与阴性耐药情况对比采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关性分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1耐药情况 耐药性分析结果显示，肺炎克雷伯菌中对氨苄青霉素耐药率最高，为85.4%(123例)，对亚胺培南、美罗培南的敏感性较高，分别为4.2%(6株)、7.6%(11株)。

2.2肺炎克雷伯菌的外排泵基因检出情况 本研究一共检测了7种类型外排泵基因，其中AcrAB-TolC 125例，占86.8%；emrD 120例，占83.3%；oqxA、oqxB均为114例，占79.2%；qacE1-sull 112例，占77.8%；tehA 98例，占68.1%；qepA未检出。

2.3相关性分析 本研究检出外排泵基因3～6个，检出耐药药物品种1～10个，耐药药物品种数与外排泵基因存在正相关性(r=0.412，P<0.05)，其中qacE△1-sull的耐药药物品种数为5种，AcrAB-TolC、emrD、oqxA、oqxB、tehA耐药药物品种数为2种，明显低于qacE△1-sull，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

肺炎克雷伯菌是人类呼吸道及肠道的常居菌，也是社区获得性和医院内感染都相关的重要条件致病菌。近年来由该菌所致的院内感染日渐增多，该菌对各种抗菌药物的耐药率及检出的耐多药肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌甚至泛耐药肺炎克雷伯菌亦有增多趋势，导致临床医生在治疗该菌导致的感染时困难重重。2015年中国细菌耐药监测网显示，在耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌中，以肺炎克雷伯菌最多，其对亚胺培南、美罗培南的耐药率均超过10.0%，各医院泛耐药肺炎克雷伯菌的总检出率达19.7%。

细菌耐药一般为各种耐药机制协同作用的结果，其中外排泵在细菌耐药性方面发挥了重要作用。AcrAB-TolC是目前被广泛研究的一种外排泵系统，AcrA是一种膜融合蛋白，横跨细胞膜，将内膜蛋白AcrB和外膜蛋白TolC连接在一起，使之形成一个贯穿细胞膜的密封通道，将药物由胞内运输到胞外。内膜蛋白AcrB负责摄取并转运特异的底物，外排多种抗菌药物如内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类等，还能为整个AcrAB-TolC 泵提供能量。外膜蛋白TolC序列相对保守，可与不同的膜融合蛋白结合，形成多种外排泵的外膜通道。若TolC 基因缺失，则外排泵作用减弱，细菌对药物的敏感性随之增加。若移除肺炎克雷伯菌的AcrAB-TolC泵，则细菌的适应性、耐药性及毒力都将改变。

本研究显示，肺炎克雷伯菌的耐药情况并不乐观，尽管对亚胺培南、美罗培南的敏感性较高，但是对其他抗菌药物都存在不同程度的耐药。相关性分析显示，肺炎克雷伯菌外排泵基因与耐药性存在相关性，外排泵类型、数量都会增加耐药风险，外排泵的基因携带数越多，则耐药的药物品种数也越多，qacE△1-sull对耐药影响较大。外排泵基因类型较多，包括ABC超家族、MFS家族、RND家族、SMR家族、MATE家族等，不同类型的基因类型引起的耐药机制不尽相同，目前已发现的外排泵基因超过30种[3-4]，本文简单分析了7种外排泵基，其中阳性率最高为AcrAB-TolC，占86.8%，最低为qepA，未检出。检出的耐药药物品种为1～10个，qacE△1-sull的耐药药物品种数高于其他类型的基因。

外排泵基因的检测在耐药预测、合理用药、耐药机制分析方面有重要意义。外排泵抑制剂已进入临床研究阶段，尽管尚无上市药物，但是外排泵抑制剂具有重大的发展潜力[5-6]。近年来，局域外排泵基因、外排泵引起耐药机制的研究越来越深入，有学者尝试针对外排泵进行新药研发，如研发新的抗菌药物剂型，对药物从纳米粒子、纳米胶束、脂质体等层面进行改造，降低药物外排泵引起的耐药风险[7]。