土大黄对银屑病小鼠皮肤组织转化生长因子-β1及神经纤维蛋白-1表达的影响*

热比姑丽·伊斯拉木，艾西木江·热甫卡提，阿布都吉力力·阿布都艾尼，阿布都帕塔尔·阿布迪热扎克，祖力皮卡尔·买买提，玉素甫江·艾力

（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆 乌鲁木齐 830011）

土大黄RumexL．是蓼科Polyonaceae酸模属Rumex植物，多年生草本，新疆维吾尔自治区南部区域农村民间调查发现，维吾尔族常用土大黄植物不同部位（根、茎、叶及全草）水煎煮液治疗银屑病等各种皮肤病，且疗效较好。2013年至今，本课题组对该药材进行了显微鉴别，以及抗炎免疫、治疗银屑病等一系列药效学试验研究［1-4］，也通过动物实验验证了土大黄民间用药的科学内涵。本研究中采用咪喹莫特（IMQ）诱导银屑病小鼠模型，通过土大黄干预，检测小鼠皮肤组织转化生长因子-β1（TGF-β1）、神经纤维蛋白-1（NRP-1）表达，旨在探讨土大黄对调节性T细胞（Treg）免疫抑制功能的影响，为进一步开发利用民间药材提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 仪器、试药与动物

1．1．1 仪器

LEICA TP1020型生物组织脱水机、LEICA RM2235型切片机、LEICA DM4000型生物显微镜、LEICA LAS V4．5型显微成像系统（德国莱卡公司）；KD-BMIII型生物组织包埋机（浙江金华科迪仪器设备有限公司）；KZPG-1A型摊片烤片机（天津天利航空机电有限公司）；LOCUS型烤箱（广东省中山市诺洁仕电气有限公司）。

1．1．2 试药

咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司，国药准字H20030128，批号为141201）；Silkee脱毛霜（美国Stella Jone′s Inc．公司授权生产，巴基斯坦制造）；醋酸地塞米松片（DXM，Dexametasone Acetate Tablet，浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33020822，批号为140670，规格为每片0．75 mg）。TGF-β1（货号为bs-0693R，批 号 为AE010840），NRP-1（货 号 为bs-0086R，批号为909086），均购自北京博奥森生物技术有限公司；Tris／EDTA修复液（货号为ZLI-9066，批号为WP143310），通用SP试剂盒（货号为SP-9000，批号为WP142714），DAB kit 20（货 号 为ZLI-9018，批 号 为K146909E），磷酸盐缓冲液（PBS，货号为ZLI-9062，批号为150511），均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；二甲苯（批号为20150302），无水乙醇（批号为20150305），均购自天津永晟精细化工有限公司。土大黄（批号为12110）由新疆华安中药饮片有限责任公司提供，由新疆大学资源与环境科学学院努尔巴依·阿不都沙力克教授通过显微鉴别鉴定为正品。

1．1．3 动物

BALB／c小鼠，84只，雌性，SPF级，日龄42～70 d，由新疆医科大学医学实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK（新）2011-0004。动物实验经新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所药物安全性评价中心［GLP中心，SYXK＜新＞2011-0005］审核，符合新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所动物伦理委员会管理准则。实验开始前检疫，经一般行为观察，选用符合要求的80只小鼠进行实验。

1．2 方法

1．2．1 土大黄提取物制备

取适量土大黄根，用8倍量的70%乙醇室温密闭浸泡1 h后回流提取3次，第1次回流2 h，第2次和第3次回流1．5 h，过滤，合并滤液减压浓缩至浸膏状，真空干燥，得干膏粉。

1．2．2 IMQ诱导银屑病小鼠模型建立［3-9］

将80只BALB／c小鼠分为2组，对照组12只，咪喹莫特诱导模型组68只。背部使用Silkee脱毛霜脱毛，背部涂抹面积约为2．0 cm×1．5 cm。对照组小鼠背部无毛区域每日涂抹凡士林，模型组小鼠涂抹以5%IMQ乳膏60 mg／d（有效药物为3 mg／d），连续6 d。

1．2．3 动物分组及给药

造模成功后，选用符合要求的60只造模小鼠随机分为模型组（给予IMQ），DXM（给予DXM 1．02 mg／kg），土大黄根提取物低、中、高剂量组［RE-L组（1 g／kg），RE-M组（2 g／kg），RE-H组（4 g／kg）］，各12只。各给药组灌胃给予相应药物，灌胃容积均为每10 g体质量0．2 mL，1次／日，对照组、模型组灌胃给予等体积的0．5%羧甲基纤维素钠（0．5%CMC-Na），连续14 d。小鼠每周测1次体质量，根据体质量变化随时调整给药剂量。

1．2．4 指标检测

1）试剂配制（临用前配制）

PBS：取1 000 mL（1袋）溶于1 000 mL蒸馏水（1∶1）中，即得。Tris／EDTA修复液：取10 mL溶于500 mL蒸馏水中（1∶50），即得。DAB显色剂：将1滴A液（约50μL）溶于1 000μL B液中（1∶200）。抗体（TGF-β1）：取抗体加PBS，抗体∶PBS为1∶500。抗体（NRP-1）：取抗体加PBS，抗体∶PBS为1∶500。

2）石蜡切片制作

固定：在研究1中BALB／c小鼠，取背部皮肤组织固定于15%中性福尔马林；取材：1．5 cm×1．5 cm，厚度不超过0．5 cm；脱水、浸蜡：分别经80%乙醇，95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明2次，浸蜡3次，均1 h；包埋：用液体石蜡；切片：0．3μm厚度切片。

3）免疫组织化学SP法

检测皮肤TGF-β1和NRP-1表达。取上述石蜡切片放入60℃烤箱内30 min，融化石蜡。从烤箱中取出后依次放入3份100%二甲苯中脱蜡，每份放置10 min。将脱蜡完毕的切片依次放入100%，95%，85%，75%乙醇中，每次3 min，最后用蒸馏水冲洗干净，完成水化。将切片置入已配好的EDTA中，微波炉预热1 min，调微波炉加热档中高10 min、高5 min进行抗原修复。室温冷却20 min后，PBS清洗3遍，每次3 min。每张切片上滴1滴（约50μL）过氧化物酶阻断剂，阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS，每张切片上滴1滴（约50μL）正常非免疫动物血清，室温下孵育10 min。除去血清，每张切片上滴1滴（约50μL）一抗（TGF-β1），4℃过夜，PBS冲洗3次，每次3 min，NRP-1和TGF-β1同法。除去PBS，每张切片上滴1滴（约50μL）生物素标记的二抗，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS，每张切片上滴1滴辣根过氧化物酶标记物，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS，每张切片上滴2滴（约100μL）新鲜配制的DAB显色剂，显微镜下观察3～10 min。自来水冲洗终止显色，苏木素复染，PBS冲洗反蓝。切片依次放入75%，85%，95%，100%乙醇中，每次3 min，脱水干燥，二甲苯透明，干性树脂封片。

1．2．5 结果判定标准［10-11］

以胞外或胞膜有棕黄色颗粒状沉积为阳性。采用积分法判断阳性表达结果，对阳性细胞进行计分，将染色强度为无、弱、中、强分别计分为0～3分，再将阳性细胞比例以≤5%，16%～25%，26%～50%，51%～75%，＞75%分别计分为0～4分，最后综合评分。

1．2．6 统计学处理

采用SPSS 17．0统计学软件处理。计数资料采用Kruskal-walls H，Mann-whitneyU非参数检验进行多组样品比较，检验水准α＝0．05。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 对IMQ诱导银屑病模型TGF-β1表达的影响

TGF-β1细胞定位细胞外基质，以胞外棕黄色颗粒状沉积为阳性。与对照组小鼠背部皮肤比较，IMQ诱导银屑病小鼠模型组小鼠背部皮肤TGF-β1表达弱或低表达（Z＝-2．673，P＜0．01）。与IMQ诱导银屑病小鼠模型组比较，RE-M组小鼠背部皮肤TGF-β1表达升高或增强（Z＝-2．673，P＜0．01）。虽DXM组、RE-L组、RE-H组表达升高或增强，但差异无统计学意义（Z＝-1．263，-1．114，-0．191，P＞0．05）。结果见图1。

2．2 对IMQ诱导银屑病模型NRP-1表达的影响

NRP-1细胞定位细胞膜，以胞膜有棕黄色颗粒状沉积为阳性。与对照组小鼠背部皮肤比较，模型组小鼠背部皮肤NRP-1表达弱或低表达（Z＝-2．309，P＜0．05）；与模型组比较，DXM组小鼠背部皮肤NRP-1表达升高或增强（Z＝-2．018，P＜0．05），RE-M组和RE-H组表达升高或增强（Z＝-2．439，-2．309，P＜0．05）；虽RE-L组表达升高或增强，但差异无统计学意义（Z＝-1．300，P＞0．05）。结果见图2。

3 讨论

银屑病的触发因素和发病机制尚未完全明确，目前认为其是一种多基因遗传背景下的免疫性疾病，其中T淋巴细胞免疫功能的紊乱是发病的关键环节，且与皮损的发生、发展和持续存在密切相关。Treg细胞是维持机体免疫耐受的主要调节细胞，能选择性地抑制一些效应性T细胞（Th17细胞）和自身反应性T细胞活化，主要通过细胞接触机制或抑制性细胞因子TGF-β1发挥主动免疫抑制作用［12-14］。寻常型银屑病患者局部皮损组织中Th17细胞反应增强，Treg细胞的免疫抑制功能减弱，证实了在寻常型银屑病局部皮损组织中存在Th17／Treg细胞的失衡［15-17］。表明银屑病的发病与效应性T细胞和自身反应性T细胞的持续激活，缺乏有效的免疫抑制机制有关，提示银屑病患者机体可能存在Treg细胞数量减少或功能障碍。通过抑制Th17细胞的活化及其细胞因子的表达，适当上调Treg细胞免疫功能，有助于银屑病的转归。

图1 土大黄提取物对IMQ诱导银屑病模型TGF-β1表达的影响（背部皮肤，×400）

图2 土大黄提取物对IMQ诱导银屑病模型NRP-1表达的影响（背部皮肤，×400）

CD4＋CD25＋Treg是目前研究得较多的一种亚型，其数量和功能异常是人类和动物自身免疫性疾病和其他炎性疾病的重要原因，其分子表面表达TGF-β1、白细胞介素10（IL-10）、NRP-1等膜分子，具有免疫抑制和免疫无能作用。研究表明，CD4＋CD25＋Teg通过膜相关TGF-β1发挥免疫抑制功能，Nrp-1能增强其共同表达的TGF-β1，从而起到免疫抑制作用［12-17］。银屑病外周血和从皮损分离的CD4＋CD25＋Treg的抑制能力均减弱，而反应性T细胞的增殖活性过强［18-23］，提示Treg的抑制作用减弱使致病的T细胞增生，可能导致自身免疫反应。

本研究中TGF-β1检测结果表明，小鼠局部皮损组织Treg细胞免疫调节功能降低，导致局部皮肤组织Th17／Treg细胞失衡，导致引起银屑病表皮免疫功能紊乱。与模型组比较，RE-M组TGF-β1表达升高或增强，表明RE-M能使局部皮肤组织Treg细胞免疫向上调节，使得恢复局部皮肤组织Th17／Treg细胞失衡，改善银屑病表皮免疫功能紊乱。虽然DXM组、RE-L组、RE-H组能使TGF-β1表达升高或增强，但差异无统计学意义（P＞0．05），提示上述药物对小鼠局部皮损组织Treg细胞功能调节无明显影响。NRP-1检测结果表明，小鼠局部皮损组织Treg细胞免疫调节功能降低，导致局部皮肤组织Th17／Treg细胞失衡，以引起银屑病表皮免疫功能紊乱。与模型组比较，DXM组、RE-M组、RE-H组均能使NRP-1表达升高或增强（P＜0．05），提示上述药物均能使局部皮肤组织Treg细胞免疫向上调节，使得恢复局部皮肤组织Th17／Treg细胞失衡，能改善银屑病表皮免疫功能紊乱。RE-L组NRP-1差异无统计学意义（P＞0．05），提示上述药物对小鼠局部皮损组织Treg细胞功能调节无明显影响。

综上所述，IMQ诱导银屑病小鼠模型皮损中存在Th17／Treg细胞失衡，引起IL-23／IL-17轴失衡，效应性T细胞功能活跃，Treg细胞免疫抑制功能减弱，最终导致免疫功能紊乱而引起疾病。通过土大黄干预能使小鼠背部皮肤组织TGF-β1和NRP-1表达升高，表明土大黄提取物能促进或增强Treg细胞功能，抑制效应性T细胞和自身反应性T细胞引起的免疫反应，恢复Th17／Treg细胞失衡，调节IMQ诱导银屑病小鼠模型IL-23／IL-17轴，从而改善银屑病表皮免疫功能紊乱，具有抗银屑病作用［12-23］。