一种用于活体细胞Zn2+检测的高灵敏度比例计量荧光探针

张长丽 徐 鉴 黄 芳 赵海荣 陈昌云

(南京晓庄学院环境科学学院，新型功能材料南京市重点实验室，南京 211171)

过渡金属在生命体系中是一个矛盾的存在，一方面这些金属在许多蛋白质中担任必需的辅因子，另一方面游离的或者水合形式的过渡金属具有一定毒性。 Zn2+是许多参与水解和基团转移反应酶中的一种辅因子[1]，也为蛋白质(如转录因子)提供了结构稳定性[2-3]，并被认为是神经传递中的一种信号分子。然而，不稳定的Zn2+会干扰许多生物过程，如缺血或癫痫发作后以及头部损伤后锌稳态被破坏， 不稳定的Zn2+增加从而导致神经损伤[4-6]，由锌摄入不足是导致肠肢端皮炎重要原因[7]，因此在生命体系中Zn2+被要求维持在低游离浓度[8-9]。 为了更好地了解锌在生物系统中的作用， 实时监测细胞中不稳定锌的分布和浓度是非常重要的。

光致发光技术以其高灵敏度、高选择性、高时空分辨率被认为是检测Zn2+最有效的手段之一。 在过去的几十年中， 人们报道了大量具有不同特性的光致发光Zn2+探针[10-16]。 尤其是比例计量型探针，可以避免光散射和探针浓度引起的伪影， 达到定量检测活体样本中Zn2+目的。 广泛应用于构建比例计量探针的机理有光诱导电荷转移(PCT)[17-25]、荧光共振能量转移(FRET)[26-35]、金属离子配位抑制激发态分子内质子转移(ESIPT)[36-43]、荧光团互变异构[44-45]和双荧光团方法[46-48]等。

除了上述一些机理以外， 利用Zn2+配位诱导芳环共面化引起分子荧光光谱的改变这一特性[49]设计Zn2+比例计量型荧光探针。 基于此机理，Ajayaghosh等构建了含5，5′-二乙烯基-2，2′-联吡啶衍生物的比例Zn2+探针， 该探针与Zn2+配位后，Zn2+诱导的芳香共平面增加了荧光分子的共轭， 导致发射波长红移[50]。 该小组后来又设计多个Zn2+探针，进一步证明了这一结论[51-53]。 然而，基于这一机制构造的比例计量型探针很少[54-56]。我们课题组基于此机理设计Zn2+荧光探针PBITA，其分子模型研究表明，Zn2+诱导的PBITA 的红光发射位移可能与2-PBI 的2 个异芳族平面的共面有关[57]。 虽然PBITA 的发射在与Zn2+结合后呈现38 nm 的红移， 但Zn2+诱导的荧光增强完全覆盖了自由PBITA 的发射。 因此，PBITA 更被认为是一个增强型的Zn2+探针。 为了进一步证实该机理，将探针PBITA 进行修饰，研制了新的Zn2+探针DBITA。在DBITA 中，在PBI 的5-位修饰供电子基N，N-二甲基， 通过分子内电荷转移促进探针的ICT(intramolecular charge transfer，ICT)效 应，一 方 面 使新Zn2+/探针配合物发生较长波长的红移，探针在与Zn2+结合前后显示出2 个发射带， 并成为一个真正的比例计量型Zn2+探针；另一方面，提高探针本身的发光效率，有利于DBITA 在生物体系中的应用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

KNO3，Zn(NO3)2，HEPES(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid),EGTA(ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)，2，6-二羟甲基吡啶和5-氯-2-硝基苯胺购自Alfa 公司。 常用药品(如邻苯二胺，三乙胺，对甲基苯磺酰氯，酸碱，常规溶剂如甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醇等)均为市售国产试剂，使用前未做进一步纯化。 乙腈分别经P2O5回流，无水K2CO3干燥，CaH2回流蒸出后使用。 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷和二甲基亚砜(DMSO)经CaH2干燥后减压蒸出使用。 四氢呋喃(THF)经钠/二苯甲酮回流蒸出后使用。 二(2-甲基吡啶基)胺(BPA)参照文献方法合成[58]。 光谱性质测试中， 所用溶剂如DMSO 等为光谱纯试剂， 购自Aldrich 公司， 水为MILIPORE 处理过的超纯水。 电喷雾质谱用LCQ 电喷雾质谱仪(ESMS，Finnigan)测定，并用ISOPRO 3.0程序模拟其同位素分布模式。1H，13C NMR 在Bruker DRX-500 或Bruker DRX-300 核磁仪上用标准脉冲序列测定(298 K)。 紫外光谱在Perkin-Elmer Lambda 35 紫外可见光谱仪上测定。 荧光光谱在AMINCO Bowman series 2 发光光谱仪上测定。 pH值用PHS-3 精密pH 计记录。 紫外和荧光光谱数据用Origin 软件包处理。

1.2 DBITA 的合成

Scheme 1 DBITA 合成线路图Scheme 1 Synthesis of DBITA

化合物Ⅰ(4-N，N-二甲氨基-邻苯二胺)和Ⅱ(二(2-吡啶甲基)(6-醛基-2-吡啶甲基)胺)根据文献方法合成[59-60]。DBITA 合成路线[61]见Scheme 1。在装有搅拌磁子、 恒压滴液漏斗和回流冷凝管的100 mL 三颈烧瓶中加入新制的化合物Ⅰ(0.070 mg 0.46 mmol)、NaHSO3(0.053 g，0.51 mmol)和乙醇(5 mL)。 加热至回流， 用恒压滴液漏斗缓慢向反应液中滴加化合物Ⅱ(0.156 mg，0.46 mmol) 的乙醇溶液10 mL，20 min 滴加完毕。 保持回流反应12 h 后停止。 减压蒸馏去除溶剂，将所得油状物用CH2Cl2和水溶解，分出有机相， 饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤， 无水MgSO4干燥，滤除干燥剂，减压蒸馏去除溶剂，柱层析分离(中性氧化铝，CH2Cl2～CH2Cl2/MeOH(200∶1，V/V))得产品0.054 g，收率26%。 棕黄色油状物，Rf=0.3(VEtOAc∶VMeOH=20∶1)。1H NMR (500 MHz，CDCl3)：δ 3.04(s，6H，-N(CH3)2)，3.91(s，2H，-CH2)，4.03(s，4H，-CH2)，6.93(s，1H，BI-H)，7.23(t，2H，J=6.0，Py-H)，7.29(d，2H,J=7.5，Py-H)，7.66～7.78(m，6H,BI-H and Py-H),8.20(d,1H，J=7.5，BI-H)，8.65 (d，2H，J=4.5，Py-H)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ 41.56，58.23，59.90,93.99,111.16,118.95，119.22，119.79，122.17,122.99,123.43,135.77，136.52，137.17，148.09，148.57,148.74,149.69,156.93，158.98。MALDI-TOF(m/z)：Calcd. 450.23,Found:450.4 for [M+H]+。 Element analysis(%) Calcd. for C27H27N7：C，72.14；H，6.05；N，21.81。 Found：C，72.89；H，6.54；N，21.03。

1.3 DBITA 的光谱性质测试

DBITA 用 光 谱 纯DMSO 配 成1.18 mmol·L-1。取DBITA 的DMSO 储备液加入到100 mL 的容量瓶中并用HEPES 缓冲溶液(50 mmol·L-1，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.2) 和DMSO 定容， 配成浓度为10 μmol·L-1的(VDMSO∶VHEPES=1∶99)溶液，然后分别进行紫外以及荧光光谱的测量。

DBITA 的Zn2+紫外和荧光滴定实验在DMSOH2O(1∶99，V/V，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)体系中进行，紫外滴定参比溶液为空白的DMSO-H2O 溶液。 向3 mL DBITA(10 μmol·L-1)的配体溶液中分别加入不同体积的Zn(NO3)2水溶液(1.2 mmol·L-1)，每次加25 μL，充分混匀后进行紫外和荧光测试。

1.4 金属离子选择性实验

金属离子选择性及Zn2+与碱金属、 碱土金属的竞争性实验都在上述DMSO-H2O 体系中进行。 实验中，向3 mL DBITA(10 μmol·L-1)的溶液中加入25 μL 浓度为1.2 mmol·L-1的金属离子水溶液，使金属离子浓度与DBITA 浓度相等， 充分混匀后进行测试。 竞争性实验中，向3 mL DBITA(10 μmol·L-1)的溶液中加入25 μL 浓度为1.2 mol·L-1的Zn(NO3)2水溶液，充分混匀后记录光谱。然后再向此溶液中分别加30 μL 浓度为1.0 mol·L-1的碱金属或碱土金属离子水溶液， 使溶液中碱金属或碱土金属的量达到10 mmol·L-1，即Zn2+浓度的1 000 倍，充分混匀后再次记录光谱。

1.5 DBITA 对生物细胞内Zn2+的造影研究

造影实验中所用HeLa 细胞在含有10%胚胎小 牛 血清(FBS，Invitrogen)，青 霉 素(100 units·mL-1)和链霉素(100 mg·mL-1)的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM，Invitrogen)中，37 ℃，5%(V/V) CO2的培养箱中培养。 为了便于成像，HeLa 细胞培养在玻璃底的培养皿中。当去掉介质后，细胞用不含金属的PBS 溶液(10 mmol·L-1)洗涤3 次，加入10 μmol·L-1DBITA 溶液在室温下孵育20 min；吸掉溶液，再用PBS 溶液洗涤3 次， 然后用激光共聚焦荧光显微镜进行观测。 细胞外源锌的引入通过在Zn(NO3)2/巯基吡啶硫酮(pyrithone(2-mercaptopyidine-N-oxide))的1∶1 的PBS 溶液(5 μmol·L-1)中孵育10 min，用激光共聚焦荧光显微镜进行造影。 造影完毕后， 细胞再用0.05 mmol·L-1TPEN(由TPEN 的浓储液通过PBS 稀释得到)处理20 min 后，再用PBS 洗涤一次后造影。

成像在Olympus FV10-ASW 激光共聚焦荧光显微镜上完成。 激发波长为488 nm，观察波长在500～540 nm 和580～620 nm 之间。

2 结果与讨论

2.1 DBITA 的光谱性质

为了便于比较， 将PBITA 与DBITA 光谱数据列于表S1。 紫外光谱实验结果表明,与PBITA 相比，由于在PBI 的5 位引入供电子基团N，N-二甲基，使DBITA 的最大吸收峰红移到340 nm (ε=1.3×104L·mol-1·cm-1)，最大吸收峰归属于DBITA 中苯并咪唑部分π-π*跃迁引起的。 荧光光谱中(图S1)，DBITA在水溶液中的荧光较强，荧光强度大约是PBITA 的3.5 倍，量子产率为0.18。 其最大激发和发射波长为362 和534 nm， 与PBITA 相比分别红移了约26 和149 nm。与PBITA 类似，在DBITA 的激发以及发射光谱中除了最大激发和发射峰外，在392 和493 nm处还同时存在一个激发和发射峰。以上结果表明，具有供电子作用的N，N-二甲基的引入，使DBITA 的紫外及发射波长发生了红移，量子产率大幅度提高，达到了预期的设计目的。

2.2 DBITA 荧光对pH 的依赖性

由于生命体内pH 值不会偏离中性太多， 因此发射光谱在近中性条件下不随pH 变化是Zn2+荧光探针能够在生命体系的应用必要条件之一。 检测了pH 值对DBITA 荧光发射谱的影响。 实验在含5 μmol·L-1DBITA 的DMSO/H2O(1∶99，V/V)溶液中进行，溶液pH 值用5 mol·L-1的HNO3及5 mol·L-1的NaOH 水溶液调节。

如图S2 所示，PBITA 的荧光发射光谱受pH 的影响较大。而DBITA 中5 位N 原子、吡啶以及苯并咪唑的N 原子在酸性条件下都容易发生质子化，减弱了分子的ICT 效应， 所以DBITA 的荧光发射强度在pH 2～6 的范围内随酸性的增强荧光强度逐渐减弱， 并且在pH 2～3 时发射波长会发生一定的红移。 在pH 6～10 的范围内DBITA 的荧光强度受pH变化较小，都体现出较强的荧光。这说明螯合团与荧光团之间的PET 效应很弱， 即使BPA 单元中的N原子质子化以后也不会使探针的荧光有明显增强，这与N，N-二甲基的推电子效应密切相关。 随pH 增大到10 以上，探针的荧光强度有所减弱，这可能是由于咪唑脱质子后使5 位的N，N-二甲基到咪唑以及吡啶的推拉电子效应(ICT 效应)减弱导致的。结果表明，DBITA 则在近中性条件下荧光强度较为稳定，具有适合应用于生命体内造影的潜力。

2.3 DBITA 与Zn2+的荧光响应行为

在HEPES 溶液中的Zn2+荧光滴定表明(图1a)，随着Zn2+的加入，DBITA 在493 和534 nm 处的发射峰逐渐降低，同时在609 nm 处出现一个新的发射峰，并且荧光强度逐渐增强。当c(Zn2+)total/c(DBITA)的值达到1 后，2 个发射峰的荧光强度不再发生改变，这说明Zn2+与DBITA 的方式结合为1∶1 结合。 用609和534 nm 处的荧光强度的比值(F609/F534)与 c(Zn2+)/c(DBITA)作图可知，F609/F534比值与c(Zn2+)total呈线性关系(图1a 插图)，比值大约从0.3 增强到1.5。 由于DBITA 存在由从推电子基团N，N-二甲基到咪唑以及吡啶单元的ICT 效应， 当DBITA 与Zn2+结合后，PBI 与Zn2+配位后不仅会使芳环平面性增强， 共轭程度增加，波长发生红移，而且由于Zn2+的拉电子作用导致拉电子单元拉电子能力增强， 使分子内的ICT 效应进一步增强，同样也会导致波长发生红移。这两种效应的叠加是导致DBITA 与Zn2+结合后波长红移要比PBITA 与Zn2+结合所导致的波长红移大的主要原因。 另外，在含EGTA/Zn2+的HEPES 缓冲溶液中对DBITA 的Zn2+配合物的Kd值进行了测定。实验结果表明DBITA 与Zn2+的结合能力要远高于PBITA(表S1)，配合物DBITA/Zn2+的Kd值为0.16 pmol·L-1(图S3)，原因可能是因为N，N-二甲基较强的供电子能力增强了咪唑N 原子的配位能力。

图1 Zn2+对10 μmol·L-1 DBITA 在HEPES 溶液中的荧光(a)和紫外(b)滴定光谱图； (a) 中插图为F609/F543 滴定曲线,(b)中插图为340 nm 波长处的紫外滴定曲线Fig.1 (a) Emission spectra of 10 μmol·L-1 DBITA (λex, 362 nm) in HEPES buffer solution； Inset in the titration profile based on the emission ratio at 609 and 543 nm, F609/F543； (b) Absorption spectra of 10 μmol·L-1 DBITA in HEPES buffer when titrated with Zn2+(1.2 mmol·L-1) solution； Inset in Zn2+titration profile according to the absorbance at 340 nm

2.4 DBITA 与Zn2+结合方式

2.4.1 紫外滴定实验

进一步采用紫外滴定、 核磁滴定和质谱研究了DBITA 与Zn2+结合方式。 紫外滴定实验结果表明当在DBITA 的HEPES 溶液中滴加Zn2+以后，DBITA在340 nm 处的吸收峰逐渐降低，并伴随有明显的红移，移动到364 nm 处(图1b)。 PBITA 吸收峰的红移是Zn2+诱导的芳环共面导致的结果。 而对于DBITA来说， 由于同时存在Zn2+诱导的芳环共面以及ICT效应的改变，使其吸收峰的红移距离(Δλabs=24 nm)要大于PBITA(Δλabs=15 nm)。 DBITA 的滴定光谱中在359 nm 处出现了等消光点，这表示自由配体已完全转化为一种锌的配合物。用340 nm 处的吸收峰吸收强度对c(Zn2+)total/c(DBITA)作图可知：当c(Zn2+)total/c(DBITA)≤1 时，紫外吸光度的降低与总锌浓度呈线性关系；而当c(Zn2+)total/c(DBITA)＞1 时，更高的总锌浓度也不会再使光谱发生明显的改变。 这表明所生成的Zn2+配合物的化学计量比为1∶1。

2.4.2 核磁滴定实验

Zn2+对DBITA 的核磁滴定实验在CD3OD 体系中进行。 由图2 可以看出，随着Zn2+的加入，除了自由的DBITA 的信号峰外(图2c)， 还出现了另一组Zn2+/DBITA 配合物的信号峰。当c(Zn2+)total/c(DBITA)=0.5 时，两组信号峰的强度基本相同(图2b)；然而其比值达到1 时， 则只能观察到Zn2+配合物的信号峰(图2a)。 加入更多的Zn2+也不会引起核磁谱的进一步变化。这同样也证实了DBITA 与Zn2+的结合比为1∶1。

详细的信号峰的指认结果列于表S2。 Zn2+的配位使得探针的所有质子的信号都发生了改变， 这表明吡啶环上的氮原子以及咪唑环的氮原子都可能参与了Zn2+的直接配位。 因此， 我们推测Zn2+与DBITA 的结合模式可能如图2d 所示。

图2 Zn2+对DBITA 在CD3OD 中的1H 核磁滴定谱图Fig.2 1H NMR spectra of DBITA in CD3OD upon Zn2+titration

2.4.3 配合物质谱研究

DBITA 的Zn2+配合物的电喷雾质谱结果如图3所示，在DBITA/Zn2+配合物的正离子电喷雾质谱中可以观察到2 个峰：256.83 处较低的峰为配合物的二价峰[DBITA+Zn2+]2+；512.33 处的峰可以归属为配合物的一价峰[DBITA+Zn2+-H]+。 这些离子峰的同位素分布方式与ISOPRO 3.0 模拟的结果基本一致，这进一步表明了DBITA 与Zn2+结合方式为1∶1 结合。

2.5 DBITA 与Zn2+结合的选择性研究

对金属离子的选择性荧光响应是一个合格探针所必须具有的重要的光学性质。 因此我们在DMSOH2O 体系中对DBITA 与Zn2+结合的选择性进行了研究。实验结果(图4a)表明，在生命体相关的金属离子存在下，DBITA 对Zn2+和Cd2+有较好的选择性比例计量响应(F609/F534)，其它的金属阳离子，如等浓度的Cu2+，Hg2+，Pb2+，CO2+，Ni2+、Mn2+、Fe2+以及1 000 倍的碱金属和碱土金属离子等都对配体荧光强度无明显影响。 由各种离子存在下DBITA 在609 和534 nm 处的荧光强度的比值可知，Zn2+和Cd2+在2 个波长下强度的比值都在1.6 左右， 而其余金属离子的比值都在0.3 左右，因此DBITA 对Zn2+的比例计量行为不会受到除Cd2+外其他金属离子的干扰。 以上结果表明，DBITA 与大部分Zn2+探针类似， 难以排除处同一族性质极为相似的Cd2+对其增强以及比例计量行为的干扰。 但由于正常细胞或生命体内没有Cd2+，所以不会对Zn2+的响应带来干扰。

图3 DBITA/Zn2+配合物的正离子电喷雾质谱Fig.3 MS spectrum of DBITA/Zn2+complex

图4 (a) HEPES 缓冲溶液中(50 mmol·L-1, pH 7.2, 0.1 mol·L-1 KNO3), 金属离子对10 μmol·L-1 DBITA 的荧光选择性响应柱状图(F609/F534, λex=362 nm)； 其中Zn2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Pb2+、Mn2+、Fe2+的含量与DBITA含量相同, Na+、K+、Ca2+、Mg2+的含量是DBITA 含量的1000 倍； (b) DBITA 及其Zn2+配合物(10 μmol·L-1)在609 和543 nm 波长下的荧光强度比值随pH 变化曲线Fig.4 (a) Emission ratio at 609 and 543 nm of DBITA (10 μmol·L-1, λex=362 nm) induced by different metal cations in HEPES buffer (50 mmol·L-1, pH 7.2, 0.1 mol·L-1 KNO3)； Final concentration for Zn2+, Cd2+, Cu2+, Fe2+, Hg2+, Mn2+,Ni2+, Hg2+, Co2+and Pb2+is 10 μmol·L-1, for Na+, K+, Ca2+, and Mg2+is 0.10 mmol·L-1, (b) Emission ratio F609/F534 of DBITA and DBITA/Zn2+complex (10 μmol·L-1) in aqueous solutions with different pH values, λex=362 nm

进一步研究了pH 变化对DBITA 的Zn2+比例计量响应行为的影响。 如图4b 所示，DBITA 在609和534 nm 处的荧光强度的比值只在酸性条件下才会增强， 而在pH≥5 的范围内基本保持不变，而DBITA/Zn2+配合物的比值在pH 4～8 之间稳定，因此可以认为DBITA 对Zn2+比例计量行为不受pH干扰，非常适合于生理环境下Zn2+的响应。

2.6 DBITA 对细胞内Zn2+的造影性能研究

由于DBITA 对Zn2+发射波长红移的比例计量响应， 因此我们利用双通道对DBITA 在细胞内的Zn2+造影能力进行了研究。 虽然DBITA 的最大激发波长在362 nm， 但从激发光谱上可以看出在405 nm 处仍可以对DBITA 进行激发。 因此，为了减小紫外激发对细胞带来的光损伤， 我们选用了波长相对较长的405 nm 作为激发波长对DBITA 进行了造影研究。 根据图S4 可知，用405 nm 作为激发波长对DBITA 的金属离子选择性以及Zn2+的比例计量响应几乎没有影响， 在荧光增强的作用上Zn2+导致的荧光增强4.95 倍增加到6.35 倍，而Cd2+导致的荧光增强5.12 倍增加到5.31 倍。

图5 DBITA 对HeLa 细胞内的激光共聚焦双通道成像: (a, e, i) HeLa 细胞用DBITA(10 μmol·L-1)溶液25 ℃孵育20 min； (b, f, j)将染色细胞暴露于5 μmol·L-1 Zn(NO3)2/2-巯基吡啶-N-氧化物溶液中5 min, 然后再用DBITA溶液孵育20 min 成像； (c, g, k)进一步用TPEN 溶液(25 μmol·L-1, 20 min)处理(b, f, j)中的细胞； (a, b, c) 500～540 nm 通道荧光图像； (e, f, g) 580～620 nm 通道荧光图像； (i, j, k)由(e, f, g)和(a, b, c)生成的比例图像,λex=405 nm； (d)与(a～c)中所示图像对应的平均信号强度柱状图； (h) 与(e～g) 中所示图像对应的平均信号强度柱状图； (l)与(i～k) 中所示图像对应的平均比值柱状图Fig.5 Dual emission ratiometric imaging of intracellular Zn2+in HeLa cells via DBITA (10 μmol·L-1, 20 min) staining at 25 ℃:(a, e, i) HeLa cells incubated with DBITA at 25 ℃for 20 min； (b, f, j) the stained cells were exposed to 5 μmol·L-1 Zn(NO3)2/2-mercaptopyridine-N-oxide solution at 25 ℃for 5 min, followed by washing with DBITA solution, (c, g, k) the cells in (b, f, j) further treated by TPEN solution (25 μmol·L-1, 20 min, bottom)； (a, b, c) Fluorescence images obtained according to the emission collected at 500～540 nm； (e, f, g) Fluorescence images obtained according to the emission collected at 580～620 nm； (i, j, k) Ratiometric images generated from (e, f, g) and (a, b, c), λex=405 nm； (d) Histogram of the average signal intensity corresponding to images shown in (a～c)； (h) Histogram of the average signal intensity corresponding to images shown in (e～g)； (l) Histogram of the average ratio value corresponding to images shown in (i～k)

DBITA 溶液对HeLa 细胞造影结果如图5 所示。 绿色通道收集500～540 nm 荧光，红色通道收集580～620 nm 荧光；荧光比值为绿色通道荧光与红色荧光通道比值。 HeLa 细胞经DBITA 溶液染色后，2个通道的比值非常低，约为0.098±0.011(图5i)；这表明细胞中的游离Zn2+相对较低，DBITA 主要以游离形式存在。 用Zn(NO3)2/pyrithione 溶液孵育后，再加入DBITA 溶液， 红色通道的荧光强度信号由117±59(图5e)增加到2 678±348(图5f)，绿色通道的荧光强度信号由1 232±69(图5a)增加到3 871±116(图5b)；因此，荧光信号的比值明显增加，大多数细胞的比值在0.73±0.04 左右，少数细胞的比例增加到1.0左右(图5j)。这表明外源性Zn2+的加入增加了细胞中Zn2+的浓度，DBITA 与Zn2+结合后导致比值增大。继续将HeLa 细胞用TPEN 溶液孵育20 min 后进行造影，结果如图5k，细胞内两个通道的比值明显下降，约为0.45±0.04，但仍高于细胞的初始比例。 这是由于DBITA 对Zn2+有很强的螯合能力，即使在高浓度的TPEN 存在下，DBITA 螯合的Zn2+仍不能完全被去除。 以上结果表明，DBITA 具有良好的细胞膜透性，实现了细胞中Zn2+比值检测。 根据文献报道，锌过量会对发育和成熟的神经系统产生深远的影响。例如， 谷氨酸能突触释放过多的Zn2+是导致缺血时神经元死亡的原因[4]，视神经损伤后Zn2+的积累导致视网膜神经节细胞死亡[62]。 同样，细胞内Zn2+的激增也与对成熟少突胶质细胞的兴奋性毒性或硝化性损伤有关[63-65]。 DBITA 具有体内Zn2+过多的诊断和治疗潜力。

3 结 论

综上所述，以2-PBI 为荧光团，通过在PBI 的5-位引入强的推电子基团N，N-二甲基，设计了Zn2+结合诱导发射光谱红移的比例计量型Zn2+探针DBITA。当探针与Zn2+结合后，可发生Zn2+诱导的芳环翻转/共面， 从而使发射峰发生较大距离的红移。进一步用紫外-可见光谱、 核磁共振氢谱和质谱研究了DBITA 与Zn2+的1∶1 结合行为。 在HeLa 细胞内的比例计量造影实验表明，DBITA 能够应用于细胞内Zn2+的定量检测。 本研究进一步证明，通过Zn2+诱导的芳环翻转/共面是构筑比例计量型Zn2+荧光探针的有效策略。 这一策略应该适合于2，2′-氮杂-1，1′-二芳基型荧光团的比例计量型探针的设计。

Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn