EAAT2基因多态性对带状疱疹后神经痛病人疼痛敏感性的影响*

华 敏 殷 琴 刘 贝 孙 凯 陈立平 许 恒 申 文△

（1徐州医科大学 江苏省麻醉与疼痛应用技术重点实验室，徐州221004； 2徐州医科大学附属医院疼痛科，徐州221002）

带状疱疹 (herpes zoster, HZ) 是潜伏性的水痘带状疱疹病毒再激活的结果，其典型特征是沿感觉神经在相应节段引起疱疹，并伴有疼痛。带状疱疹最常见的并发症是带状疱疹后神经痛 (postherpetic neuralgia, PHN)[1]，PHN是一种典型的慢性神经病理性疼痛，病程迁延难愈，常表现为痛觉过敏和痛觉超敏，伴有情感及睡眠障碍，能极大地限制日常活动，降低病人的生活质量,严重者甚至有自杀倾向。带状疱疹后神经痛的治疗目的首要的是尽早有效地控制疼痛，但是目前临床上对于带状疱疹后神经痛病人的疼痛控制仍不尽人意[2]。

已经有越来越多的研究表明疼痛敏感性的个体差异可能与基因多态性相关。许多神经递质参与神经病理性疼痛形成与发展，其中谷氨酸是影响突触可塑性，参与中枢敏化的重要神经递质，是诱发疼痛形成和持续的重要因素[3]。谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1, GLT-1) ，也称为兴奋性氨基酸转运体2 (excitatory amino acid transporter 2,EAAT2）,负责大脑中约90%的谷氨酸再摄取，在维持突触间隙的谷氨酸稳态中起着重要作用。在大鼠的慢性疼痛模型中，脊髓中GLT-1表达下调，这表明GLT-1参与了慢性疼痛的发展[4～6]。已有多项研究表明通过上调脊髓GLT-1，降低谷氨酸浓度可以减轻痛觉过敏[7,8]。

有研究表明 EAAT2基因启动子区(A-181C,rs4354668)单核苷酸多态性影响GLT-1的表达，从而影响血浆谷氨酸浓度[9,10]。但是目前并没有直接的研究证据表明EAAT2基因多态性与神经病理性疼痛病人疼痛敏感性之间的相关性。带状疱疹后神经痛是一种典型的疼痛敏感性异常的疾病，本研究首次探讨EAAT2基因多态性与带状疱疹后神经痛病人疼痛敏感性之间的相关性，为临床神经病理性疼痛的治疗提供参考。

方 法

1.一般资料

选择2018年1月至2018年8月于徐州医科大学附属医院疼痛科住院确诊为带状疱疹后神经痛的病人128例（男66例、女62例，年龄42～85岁），并纳入同期该院的健康体检者116例作为对照组（男60例，女56例，年龄38～82岁）。所有受试者均为自然人群，且无血缘关系。两组间的年龄和性别差异无统计学意义。本研究已通过徐州医科大学附属医院伦理委员会批准（伦理号：XYFY2018-KL040-01），并与受试者签署知情同意书。

排除标准：①中枢神经系统疾病或精神性疾病者；②合并其他急慢性疼痛者；③患有严重心脑血管疾病者；④严重肝、肾功能损害者；⑤不能进行疼痛评估者。

剔除标准：①突发其他急性疾病者；②带状疱疹继发于其他疾病，如恶性肿瘤等；③治疗过程中数据采集不全者。本试验过程中共剔除了12例病人，失访率约10%。

2.方法

（1）评估：治疗开始前记录病人的疼痛数字评分(numerical rating scale, NRS)：0分为无痛，1～3分轻度疼痛，4～6分中度疼痛，7～10分重度疼痛，根据病人的疼痛评分，分为轻度、中度和重度疼痛亚组。本试验中的带状疱疹后神经痛病人NRS评分均在4分以上，故无轻度疼痛亚组，中度和重度疼痛亚组例数分别为91例和37例。对于中重度疼痛病人采用加巴喷丁及阿片类药物进行镇痛治疗（NRS评分≥4分开始使用阿片类药物），NRS评分降低≥50%为明显缓解[2]。采用每日等效口服吗啡剂量 (morphine equivalent daily dose, MEDD)对阿片类药物用量进行统计，换算公式为曲马多600 mg/d =羟考酮30 mg/d =芬太尼透皮贴4.2 mg/72 h = 吗啡60 mg/d[11]。

（2）基因分型：抽取研究对象外周静脉血样2 ml，DNA提取采用树脂型TM基因组DNA提取试剂盒（上海赛百盛基因技术有限公司），采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术进行基因分型。PCR引物设计由生工生物工程（上海）公司设计，引物序列:正向引物5’-CTGCCACCTGTGCTTTGCT-3’，反向引物5’-GAGGGATCGCCTGCAAATCC-3’。PCR反应体系同普通PCR扩增，反应条件为95℃预变性4 min，然后进行35个循环（95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s），72℃终末延伸10 min，扩增产物长为210 bp。将PCR产物用限制性核酸内切酶NciI[12]进行酶切，酶切反应总体系为50 μl,包括PCR 产物 10 μl、内切酶 1 μl、10×CutSmart Buffer 5 μl,灭菌水34 μl。此反应体系置于37℃的恒温箱中酶切1～16 h，反应终止后用2% 琼脂糖凝胶进行电泳，电压120 V，时间45 min，采用全自动凝胶成像系统拍照确定基因型。rs4354668位点野生型纯合子(AA)为210 bp，突变型杂合子(AC)为210，110和100 bp，突变型纯合子(CC)为110和100 bp。在琼脂糖凝胶电泳图上难以观察区分110 bp和100 bp条带，但并不影响基因型的判读（见图1）。随机抽取不同基因型DNA标本的PCR产物寄送上海生工公司进行测序（见图2），以验证PCRRFLP方法基因型鉴定的准确性。

3.统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(D)，组间比较用两独立样本t检验或单因素方差分析；非正态分布资料采用M (P25，P75)表示，组间比较采用非参数检验；计数资料和Hardy-Weinberg平衡采用X2检验。分析爆发痛发生相关的因素采用单因素分析及二元 Logistic回归模型的多因素分析。以P< 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.Hardy-Weinberg遗传平衡

图1 rs4354668位点基因型凝胶电泳图谱Fig.1 Gel electrophoresis of rs4354668 genotype Note: 1: wild type homozygous AA; 2,4,5:mutant heterozygous AC; 3: mutant homozygous CC; M1: DNA marker I

带状疱疹后神经痛组纳入受试者128例，经检测EAAT2 -rs4354668位点AA/AC/CC基因型分别为11/52/65例，等位基因A频率为28.91%；对照组纳入健康志愿者116例，AA/AC/CC基因型分别为9/51/56例，等位基因A频率为29.74%。两组研究对象 EAAT2 -rs4354668 基因型及等位基因分布符合Hardy-Weinberg 遗传平衡，说明研究对象具有良好的群体代表性。

2.带状疱疹后神经痛组与对照组基因型及等位基因分布的比较

带状疱疹后神经痛组与对照组相比基因型及等位基因分布差异无统计学意义（P> 0.05，见表1）。

3.带状疱疹后神经痛组不同亚组病人的一般资料和临床特征的比较

（1）不同疼痛程度病人的一般资料和临床特征比较：不同疼痛程度带状疱疹后神经痛病人的一般资料和临床特征比较，结果显示中度和重度疼痛亚组病人年龄比较有显著差异，重度疼痛亚组病人年龄明显高于中度疼痛亚组病人，差异有统计学意义(P= 0.043)，而性别，体重指数，受累神经节段，合并症未见明显差异（P> 0.05，见表2）。

（2）不同基因型及等位基因病人的一般资料和临床特征比较：不同基因型及等位基因带状疱疹后神经痛病人的一般资料和临床特征比较差异无统计学意义（P> 0.05，见表3）。

4.EAAT2-rs4354668位点基因多态性对带状疱疹后神经痛病人疼痛程度的影响

不同疼痛程度带状疱疹后神经痛病人的基因型及等位基因分布差异无统计学意义（P> 0.05，见表4）。

5.EAAT2-rs4354668位点基因多态性对带状疱疹后神经痛病人阿片类药物用量的影响

在中度及重度疼痛亚组中，EAAT2基因rs4353668位点各基因型病人之间阿片药物用量比较差异无统计学意义（P> 0.05，见表5）。

图2 rs4354668位点基因型测序图Fig.2 Genotype sequencing diagram of rs4354668

6.影响带状疱疹后神经痛病病人爆发痛发生的临床病理特征单因素分析

把本研究中可能影响带状疱疹后神经痛病人爆发痛发生的混杂因素，包括年龄、性别、受累神经节段、合并症（高血压、冠心病、糖尿病）及EAAT2-rs4354668位点基因型等对爆发痛发生的影响分别进行单因素分析，结果显示均无明显统计学意义（P> 0.05，见表6）。将P< 0.2的影响因素即年龄和受累神经节段进一步纳入多因素Logistic回归分析，结果示无明显统计学意义（P> 0.05，见表7）。

讨 论

脊髓背角神经元谷氨酸能系统的过度激活是导致神经病理性疼痛状态下神经元异常激活的关键机制。尽管临床和动物研究数据表明谷氨酸能系统参与神经病理性疼痛的发生发展，但与谷氨酸能系统相关的遗传多态性对神经病理性疼痛的疼痛敏感性的可能贡献尚未确定。EAAT2基因定位于11p13-p12，长168.8 kb，由16个外显子组成，其启动子区的序列分析显示rs4354668 (A-181C)位点的单核苷酸突变使本来应结合转录因子结合元件激活蛋白-2 (AP-2)位点的序列消失，而产生了转录抑制因子结合元件GC结合因子2 (GCF2)的新序列，降低GLT-1的表达，使携带突变的等位基因C的病人显示更高的血浆谷氨酸浓度[9]。已有多项动物实验表明通过调节GLT-1水平，可以影响疼痛敏感性。带状疱疹后神经痛是一种临床上常见的神经病理性疼痛，伴有明显的痛觉敏感，重度疼痛病人还常伴有爆发痛，由此本研究提出EAAT2基因多态性可能影响带状疱疹后神经痛病人疼痛敏感性的假设。

表1 rs4354668位点基因型及等位基因频率分布[n (%)]Table 1 Distribution of genotype and allele frequency of rs4354668 [n (%)]

表2 不同疼痛程度带状疱疹后神经痛病人的一般资料和临床特征(D)Table 2 General data and clinical features of the patients with different levels of pain (D)

表2 不同疼痛程度带状疱疹后神经痛病人的一般资料和临床特征(D)Table 2 General data and clinical features of the patients with different levels of pain (D)

*P < 0.05

中度疼痛Moderate pain (n = 91) 重度疼痛Severe pain (n = 37) P年龄Age (years) 68.0±10.3 72.2±11.0 0.043*性别Gender男/女Male/Female 48/43 18/19 0.674体质指数BMI (kg/m2) 23.3±3.2 23.6±2.6 0.708受累神经节段Nerve segment颅+颈/胸/腰Cranial + Cervical/Thoracic/Lumbar 30/54/7 16/19/2 0.532合并症Comorbidity高血压/冠心病/糖尿病Hypertension/Coronary disease/ Diabetes 34/13/17 10/7/10 0.370

表3 不同基因型及等位基因带状疱疹后神经痛病人的一般资料和临床特征(D)Table 3 General data and clinical features of the patients with different genotypes and alleles (D)

表3 不同基因型及等位基因带状疱疹后神经痛病人的一般资料和临床特征(D)Table 3 General data and clinical features of the patients with different genotypes and alleles (D)

特征Features 基因型Genotype P 等位基因携带者Allele carrier P AA AC CC A C年龄 Age (years) 67.2±8.6 69.1±11.1 69.5±10.7 0.807 68.8±10.7 69.4±10.8 0.748性别Gender男/女Male/Female 8/3 28/24 30/35 0.241 36/27 58/59 0.332体质指数BMI (kg/m2) 23.2±3.3 23.6±3.0 23.3±3.1 0.863 23.5±3.1 23.4±3.1 0.844受累神经节段Nerve segment颅+颈/胸/腰Cranial + Cervical/Thoracic/Lumbar 3/7/1 18/30/4 25/36/4 0.925 21/37/5 43/66/8 0.886合并症Comorbidity高血压/冠心病/糖尿病Hypertension/Coronary disease/Diabetes 4/3/0 18/7/9 22/10/18 0.286 22/10/9 40/17/27 0.493

表4 不同疼痛程度带状疱疹后神经痛病人的基因型和等位基因分布的比较 [n (%)]Table 4 Comparison of the genotype and allele distribution among patients with different levels of pain [n (%)]

表5 中、重度疼痛带状疱疹后神经痛病人不同基因型间阿片类药物用量比较Table 5 Comparisons of opioid doses among different genotypes of moderate and severe pain patients

表6 影响带状疱疹后神经痛病人爆发痛发生的临床特征单因素分析Table 6 Univariate analysis of clinic features of breakthrough pain (BTP) in patients with postherpetic neuralgia

表7 影响带状疱疹后神经痛病人爆发痛发生的多因素Logistic 回归分析Table 7 Multivariate Logistic regression analysis of breakthrough pain (BTP) in patients with postherpetic neuralgia

本研究结果表明，不同疼痛程度带状疱疹后神经痛病人EAAT2基因的启动子区(rs4354668)的基因型频率和等位基因频率均无差异；中、重度疼痛带状疱疹后神经痛病人不同基因型间阿片类药物用量无明显差异；rs4354668位点基因多态性对带状疱疹后神经痛病人爆发痛的发生无明显影响。中度和重度疼痛亚组病人的年龄比较差异有统计学意义(P= 0.043)，已有研究表明PHN的患病率随年龄增加而逐渐升高[13]，在70岁及以上者中PHN的患病率可达75%[14]。高龄病人免疫力下降，病毒损害神经后难以自我修复，发生PHN的概率大，疼痛程度和持续时间也会增加。上述结果提示EAAT2基因rs4354668位点单核苷酸多态性对带状疱疹后神经痛病人疼痛敏感性无影响。

Lepore等的研究发现，单侧颈髓损伤的大鼠的慢性热痛觉过敏表现伴随着背角神经元和星形细胞的活化以及谷氨酸转运体GLT-1的丢失，进一步的研究发现过度表达GLT-1，可以减轻热痛觉过敏并减少颈脊髓损伤后的背角神经元激活，表明通过调节GLT-1水平可以减轻神经元过度兴奋，缓解神经病理性疼痛[15,16]。Shi等人的研究发现，2型糖尿病大鼠的痛觉过敏和痛觉超敏行为与谷氨酸的水平增加和脊髓中GLT-1表达水平减弱有关[8]。而Le等对慢性坐骨神经压迫损伤的大鼠研究却并没有发现疼痛行为与谷氨酸转运体表达之间有特定的因果关系[17]。Shin等人通过对133名偏头痛病人的研究发现，rs4354668位点不同基因型病人之间头痛发作的频率，疼痛强度和持续时间均没有差异，但发现A等位基因的偏头痛病人使用止痛药的频率明显高于没有A等位基因的偏头痛病人(P= 0.019)，推测EEAT2基因多态性在镇痛药的过度使用中具有潜在的遗传影响[18]。本实验的研究对象是带状疱疹后神经痛病人，结果显示并未发现EAAT2基因rs4354668位点基因多态性与疼痛敏感性有显著的相关性，与上述实验结果相一致。

本研究的不足之处：第一，本试验未能检测病人的GLT-1和血浆谷氨酸水平，同时病人的精神状态，饮食，睡眠等也可能影响体内激素水平，从而影响试验结果。之前的研究表明，EAAT2基因多态性可影响GLT-1和血浆谷氨酸水平，而GLT-1和血浆谷氨酸水平与疼痛敏感性密切相关。第二，爆发痛是指在基础疼痛控制相对稳定和药量充足的前提下，自发的、或由触发因素引起的短暂疼痛加重[19]。目前对带状疱疹后神经痛病人爆发痛的研究不多，但临床上很常见。本试验纳入了可能影响爆发痛发生的相关因素进行单因素分析，结果显示无明显差异。进一步行多因素Logistic回归分析亦未示明显差异。这可能与爆发痛组样本量较少（24例）有关。第三，阿片类药物的作用涉及多种复杂机制，已有研究表明COMT, OPRM1, ABCB1, GCH1等多个SNP位点可影响阿片类药物的个体化应用[20～22]，而本试验中仅研究了单一的SNP位点。第四，除了本研究中的SNP位点以外，EAAT2基因仍可能存在其他与疼痛相关的SNP位点，本实验并未纳入考虑。第五，由于本研究入组的样本量有限及存在性别、年龄、受累神经节段及合并症等干扰因素，仍需要进一步研究证实结果的可靠性。

综上所述，在本试验中EAAT2基因rs4354668位点基因多态性对带状疱疹后神经痛病人的疼痛敏感性无明显影响，其基因多态性可能不是带状疱疹后神经痛病人疼痛敏感性个体差异的机制。