制备天麻染色体有丝分裂中期标本的组织筛选

2020-02-08杨通静王沁

中国农业文摘·农业工程 2020年5期

杨通静王沁

摘要：通过对天麻原球茎、初生块茎、柱头、花粉帽等组织，在不同时间段制备染色体有丝分裂中期标本。比较发现，上午9：00—11：00期间，用柱头制备的标本最好。

关键词：天麻；柱头；染色体；有丝分裂

基金项目：贵州省联合基金“天麻核型分析研究”[黔科合J字LKN[2013]17号]；贵州省科学技术基金[2014]7697 号，项目名称：鲜天麻保存过程中生理特性变化研究。

天麻是具有内生菌根的兰科植物。它的植物体没有根与绿叶，种子萌发后，主要依靠分解侵入其体内的蜜环菌菌丝生活[1]。因此，天麻的有丝分裂标本制作不能像其他植物那样选用根、叶等组织结构制备[2-4]。1984年梁汉兴[5]以花粉小孢子观察了原天麻染色体单倍体数目。2010年王德信[6]也以花粉小孢子为材料，观察减数分裂过程中的细胞学特征。鉴定出天麻单倍体的染色体数目为18，但天麻染色体特征不能较好的呈现，也无法鉴定天麻的染色体倍数。为了有效观察天麻染色体特征和鉴定其倍性，笔者拟从天麻不同组织、不同时间取样制片，筛选出最佳取材部位，用于观察天麻染色体有丝分裂中期的结构特征。

1 材料与方法

1.1 材料

品种：纯化4代以上的红秆天麻。培育地点：天麻种质资源圃。种质来源：贵州省农作物品种资源研究所真菌室课题组。

1.2 方法

1.2.1 材料培养方法

（1）天麻花柱頭培养

将成熟天麻（鹦哥嘴完整无损伤）块茎埋于湿度在40%左右沙土中，置于22-25oC，相对湿度60%的环境下，让其抽薹。

（2）花粉帽培养

将成熟天麻（鹦哥嘴完整无损伤）块茎埋于湿度在40%左右沙土中，置于22-25oC，相对湿度60%的环境下，让其抽薹。

（3）原球茎培养

将刚采摘（每年的5-7月）的成熟的天麻种子与萌发菌进行拌种，置于培养好的固定菌床中覆土培养，自然条件下萌发，取不同大小的原球茎在不同时间段进行观察比较。

（4）初生茎

成熟天麻块茎的鹦哥嘴人为掰断后，将其块茎埋于湿度在40%左右沙土中，自然条件下生长，在不同时间取不同块茎大小制片观察。

1.2.2 标本制备方法

制片基本流程：取材——预处理——固定——解离——清洗——染色——压片——镜检。

1.3 制片

取材：1）柱头：分别在不同开花期和同一天不同时间段取柱头；2）花粉帽：分别在不同开花期和同一天不同时间段取材；3）原球茎：分别在不同发育期和不同时间段取原球茎；4）初生块茎：分别在不同发育期和不同时间段取初生块茎。

预处理：将材料置于0.002%-0.004%/L 8-羟基喹啉中，室温处理50min左右，取出用蒸馏水漂洗2-3次。

固定：然后用新配的卡诺固定液进行固定，时间为1h。

酸解：将清洗好的材料取下柱头，因为天麻花的柱头异于其他花，取时轻用镊子进行提取，置于1M盐酸中60oC条件下酸解5min。

清洗：吸去酸解液，用蒸馏水轻轻洗2-3次。

染色：将固定后的材料（组培材料取茎尖0.2cm）置于干净载玻片上，加改良后的卡宝品红染液1-2滴，染色50min。

制片：用45%的冰醋酸洗1-2次，取干净的盖玻片盖在材料上，先用铅笔头或者镊子轻轻敲打，再用拇指压片。

镜检：制备好后的标本在显微镜下观察，对有丝分裂相好的细胞进行观察、拍照。

1.3.1 分裂中期细胞计数方法

分别在10×10倍和10×100倍显微镜下观察、统计单张标本中处于有丝分裂中期细胞总数。每个组织同时制备3份染色体标本进行镜检，计算平均数。

1.3.2 制备染色体有丝分裂标本的组织及时间段优劣比较

通过比较不同时间段、不同组织制备的标本中处于染色体有丝分裂中期的细胞数量越多，说明越利于制片观察。

2 结果与分析

2.1 不同组织部位制备天麻有丝分裂标本观察对比结果

表1、表2及图1、2的结果表明，天麻花粉帽在自然情况下，开花前5天花粉帽分裂处于高峰期，每天的 9：00-11：00处于有丝分裂中、后期的细胞较多，但是，总体数量相对较少。天麻花柱头在自然情况下，开花前5天的上午9：00-11：00处于中期分裂相的细胞较多，单张制片中处于有丝分裂中期细胞数相对较多。

表3、表4及图3、4的结果表明，自然状态下，原球茎、天麻初生茎的细胞活跃期较为集中在 10：00-12：00期间，此时，处于染色体有丝分裂中期的细胞数量相对较多，但是，在下午13：00-14：00间，也能观察到处于有丝分裂中期的细胞存在，但是相对较少。

2.2 天麻不同组织部位制备的标本难以程度结果

表5结果表明，四种组织中，花粉帽、原球茎和初生茎细胞壁难以解离，细胞不易分散，压片难度大。柱头制片各环节都较为容易，镜检结果较好。

3 结论与分析

1）用天麻柱头制备染色体有丝分裂标本最佳。天麻初生块茎和次生块茎中活跃的细胞数量大大增加。但是，制片难度大，可能与细胞壁纤维化程度大有关系，且细胞活跃期分布不是太明显可能是与由于土壤温度回升较慢所致。

2）天麻开花当天至开花前5天，上午9：00- 11：00，柱头细胞分裂处于活跃期，且柱头组织比较软，有利于染色体标本的制备。天麻开花后随着时间的推移，其柱头表面黏性逐渐减弱，组织结构逐渐变硬，导致制备染色体有丝分裂中期标本过程中解离难度增加，开花3天后的柱头很难获得分散较好的细胞标本。这可能是柱头暴露在空气中后，水分挥发导致其组织结构收缩变硬，同时制片过程中没有促使细胞膜扩张处理所致。