补肾益气活血方对胚胎着床障碍大鼠子宫内膜孕激素受体和信号传导与活化转录因子3表达的影响

钟志艳 黄冬梅 黄光英

胚胎着床是制约体外受精—胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)成功的关键因素，其中子宫内膜容受性发挥着重要作用。卵巢甾体激素、各类细胞因子、转录因子以及血管活性物质在调节子宫内膜着床微环境中扮演重要角色，其中孕激素是着床所必需的，其功能主要由孕激素受体介导，通过促进子宫内膜蜕膜化的改变，促进胚胎着床。胚胎着床过程中，类固醇激素对子宫内膜的作用受到许多重要的细胞因子和(或)生长因子调节，其中如白介素-6(interleukin 6, IL-6)家族中多种细胞因子：白介素-11(interleukin 11, IL-11)、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)等，它们被证实与胚胎着床过程关系密切；其均通过gp130受体进行胞内信号传递，并介导信号传导与活化转录因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的激活[1]。STAT3作为STAT家族中的重要成员，是一种具有转录作用的蛋白质，在调控细胞生长、增殖、分化及免疫活动中具有重要作用。实验研究发现，STAT3及其下游通路对人类子宫内膜基质细胞的增殖和分化至关重要[2]；条件性敲除子宫内膜上皮细胞的STAT3基因，雌性小鼠表现为不孕[3]。课题组前期临床实践[4]发现补肾益气活血方能促进多次人工辅助生殖治疗失败的患者受孕；且动物实验研究[5]表明，补肾益气活血方能通过调节胚泡着床障碍小鼠雌孕激素及其受体的表达，促进胚胎着床。基于上述文献调研及结果，本研究进一步探讨补肾益气活血方对胚胎着床障碍大鼠孕激素受体(progesterone receptor, PR)和STAT3的影响。通过采用米非司酮诱导的胚胎着床障碍大鼠模型，观察补肾益气活血方对模型大鼠子宫内膜PR和STAT3表达的影响，探讨补肾益气活血法促进胚胎着床的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用性成熟、未孕SPF级Wistar雌鼠，体重220～240 g；成年、性成熟SPF级Wistar雄鼠，体重250～300 g；所需动物全部来自于湖北省卫生与疾病防控中心，许可证号为SCXK(鄂)2015-0018。

1.2 主要药品和试剂

米非司酮(华润北京紫竹制药公司，规格25 mg/片)由同济医院药房提供，片剂碾碎后溶于无水乙醇，继而悬浮于食用芝麻油溶液，制配为2 mg/mL的米非司酮—芝麻油悬液。补肾益气活血方(桑寄生18 g、黄芪14 g、当归9 g、川芎9 g、丹参9 g)免煎颗粒由同济医院中药房提供，用无菌蒸馏水配成1.35 g/mL生药浓度的无菌制剂，4℃保存。黄体酮注射液(浙江仙琚制药股份有限公司，规格1 mL∶10 mg)由同济医院药房提供。大鼠孕激素酶联免疫吸附实验试剂盒(EHC9030)购自武汉欣博盛公司，DAB显色试剂盒及Cocktail蛋白酶抑制剂由武汉谷歌生物科技有限公司提供；组织总蛋白提取试剂盒以及BCA蛋白溶度测定试剂盒由武汉博士德公司提供。设计引物、提取组织总RNA的Trizol提取试剂盒、反转录试剂盒(RR036A)、SYBR荧光定量试剂盒(RR420A)、RNA酶游离水购自Takara公司。兔抗大鼠PR多克隆抗体(DF6829)购自美国Affinity生物技术公司；兔抗大鼠STAT3(4904)单克隆抗体购自美国CST公司；兔抗大鼠GADPH内参(ab37168)多克隆抗体购自美国Abcam公司；荧光素标记的羊抗兔荧光二抗(072071506)购自KPL公司。

1.3 主要设备与仪器

各规格微量加样枪(德国Eppendorf)，4℃、-20℃、-80℃冰箱(中国海尔)，制冰机(日本松下)，纯水系统(美国Millipore)，电泳槽、电泳仪及转膜槽(美国Bio-Rad)，光学显微镜(日本奥林巴斯)，核酸蛋白质分析仪(美国Quawell)，PCR扩增仪(德国耶拿)，一步法实时荧光定量PCR仪(美国ABI)，Quantityone分析软件(北京六一厂)，酶标仪(美国Bio Tek)，佳能350 d显微照相系统(日本佳能)，双色近红外激光扫描摄像系统(美国Odyssey)。

1.4 动物分组与处理

所有大鼠在适应性喂养一周后，连续观察雌鼠两个动情周期，动情周期正常则纳入实验。将处在动情前期的雌鼠和雄鼠于下午6点按2∶1进行合笼交配，次日上午8点观察阴道涂片，以出现大量精子者记录为怀孕第1天。将全部孕鼠随机分为正常组、模型组、中药组和黄体酮组，其中正常组10只，模型组22只，中药组15只，黄体酮组13只。除正常组外，其余三组在怀孕第3天上午9点皮下注射5.5 mg/kg米非司酮—芝麻油悬液进行造模处理，正常组则皮下注射等体积芝麻油溶液。中药组于造模当日下午4点开始每日给予补肾益气活血方灌胃(根据人-大鼠体表面积换算，每只大鼠每次给予2.3 mL灌胃)直至处死前一天，与此同时，黄体酮组每日给以黄体酮注射液20 mL/kg(0.5 mL/只)肌肉注射直至处死前一天。

1.5 标本收集与指标检测

各组大鼠于怀孕第8天下午4点用1%的戊巴比妥腹腔麻醉后进行剖腹。观察并记录子宫的颜色、形态、胚泡大小及数目，经腹主动脉采血留取血液标本后摘取子宫标本，记录每只大鼠妊娠情况及着床胚胎个数。血液标本经3000 r/min，离心15分钟后获取血清，分装后存于-80℃冰箱，用于ELISA检测。根据ELISA试剂盒使用说明检测各组大鼠血清孕酮水平，RT-PCR法检测各组大鼠子宫内膜PR和STAT3 mRNA的表达，Western blot法检测各组大鼠子宫内膜PR及STAT3蛋白表达。

1.5.1 ELISA检测血清孕酮水平 严格按照ELISA试剂盒的使用说明和操作步骤，检测各组大鼠血清孕酮水平。ELISA试剂盒的检测范围为0.5～30 ng/mL，灵敏度为0.2 ng/mL，组内及组间变异系数不超过15%。

1.5.2 RT-PCR检测子宫内膜中PR及STAT3 mRNA含量 从-80℃冰箱中取出适当保存的子宫胚胎标本，在冰面上解冻数分钟后，将组织放入无菌的一次性培养皿中，刮取子宫内膜组织(第8天子宫组织在体视显微镜下小心去除胚胎)，加入1 mL预冷的Trizol裂解液，在冰上充分碾磨，按试剂盒说明书步骤提取内膜组织总RNA，各管取2 μL检测样本RNA的纯度和浓度，A260/A280在1.8～2.0便可进入下一步逆转录过程。根据公式(2 μg样本=浓度μg/μL×体积20μL=样本体积+ Mix体积+ dH2O体积)计算出样本和dH2O的体积，进行逆转录反应。用逆转录所得的cDNA做模板，进行RT-PCR扩增，SYBR®Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL、Rox Reference Dye(50×) 0.4 μL、稀释后上游引物(10μm) 0.4μL、稀释后下游引物(10 μm) 0.4μL、cDNA 2 μL和RNase-Free H2O组成20 μL反应体系，每个样本做3个平行复孔，以β-actin为内参。采用Comparative Delta-delta CT法，每个标本的相对RNA含量通过2-ΔΔCT计算得到。具体引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5.3 Western blot检测子宫内膜中PR及STAT3蛋白表达 从-80℃冰箱中取除冻存的子宫胚胎标本，在冰上解冻数分钟后，于冰上将组织置于无菌的一次性培养皿中，刮取子宫内膜组织(第8天子宫组织在体视显微镜下小心去除胚胎)，按1 mL∶20 μL∶10 μL的比例配备组织蛋白提取液、蛋白酶抑制剂及PMSF的混合液，子宫内膜组织与该混合液与按1∶10加入。在冰面静置30分钟后，经4℃低温离心机获取上清液，转速12000 r/min，离心15分钟。经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度后，每个蛋白提取物样品大致定容，再加1/4体积的上样缓冲液，煮沸10分钟蛋白变性，所得样品分装后保存在-80℃冰箱。制备10%SDS-PAGE胶，加样后进行电泳，先80伏特30分钟而后120伏特1小时跑胶，将跑胶后分离的目的蛋白转移到PVDF膜上，在室温条件下，经过5%的脱脂牛奶封闭2小时后，去除多余牛奶，给予相应一抗于4℃冰箱孵育过夜。PR、STAT3和GAPDH(内参)的一抗稀释浓度分别为1∶1000、1∶2000、1∶5000。第二天PBST洗5次,每次10分钟，避光加入恰当的荧光二抗(按1∶10000稀释)室温孵育1小时，PBST避光洗4次,每次5分钟，用双色近红外激光摄像系统扫膜。所得图片用Image J计算灰度比值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠胚胎着床情况比较

肉眼观察可见正常组子宫血供丰富，胚泡呈串珠状隆起，大小均等，分布均匀；模型组子宫苍白，部分子宫腔变细，胚泡数减少，胚泡较多融合；中药组子宫血供较模型组丰富，胚泡数较模型组增多，胚泡大小及分布较为均等；黄体酮组子宫血供较为丰富，但不及正常组，胚泡数较模型组增多，胚泡大小及分布较模型组均匀。见图1。与正常相比，模型组怀孕率明显下降(P<0.05)，平均着床胚胎数明显减少(P<0.05)；与模型组比较，中药组和黄体酮组怀孕率及平均着床胚胎数均明显增加(P<0.05)；与黄体酮组相比，中药组妊娠情况无显著性差异(P>0.05)。见表2。

注：A：正常组；B：模型组；C：中药组；D：黄体酮组。

图1各组胚胎着床障碍大鼠第8天子宫形态图

表2 各组胚胎着床障碍大鼠第8天 怀孕率及平均着床胚胎数比较

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

2.2 各组胚胎着床障碍大鼠血清孕酮含量比较

与正常组比较，模型组血清孕酮含量明显下降(P<0.05)；与模型组相比，中药组和黄体酮组血清孕酮含量均显著增加(P<0.05)；与黄体酮组比较，中药组血清孕酮含量明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组胚胎着床障碍大鼠血清孕酮含量比较

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与黄体酮组相比，cP<0.05。

2.3 各组胚胎着床障碍大鼠子宫内膜中PR及STAT3的mRNA表达情况

与正常组相比，模型组子宫内膜PR mRNA表达显著降低(P<0.05)，STAT3 mRNA表达无显著差异(P>0.05)；与模型组相比，中药组子宫内膜PR mRNA表达显著增加(P<0.05)，STAT3 mRNA表达无显著差异(P>0.05)，与模型组相比，黄体酮组子宫内膜PR及STAT3 mRNA表达均无显著差异(P>0.05)；与黄体酮组相比，中药组子宫内膜PR及STAT3 mRNA表达均无显著差异(P>0.05)。见表4。

表4 各组胚胎着床障碍大鼠子宫内膜中PR及STAT3 的mRNA表达比较

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

2.4 各组胚胎着床障碍大鼠子宫内膜PR及STAT3蛋白表达情况

与正常组相比，模型组子宫内膜PR及STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05)；与模型组比较，中药组和黄体酮组子宫内膜PR及STAT3蛋白表达显著增加(P<0.05)。与黄体酮组相比，中药组子宫内膜PR及STAT3蛋白表达无显著差异(P>0.05)。见图2表5。

注：N：正常组；M：模型组；BR：中药组；P：黄体酮组。

图2 各组胚胎着床障碍大鼠子宫内膜PR 及STAT3蛋白表达(Western blot)表5 各组胚胎着床障碍大鼠子宫内膜中PR 及STAT3蛋白表达比较

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

3 讨论

众所周知，孕激素是维持妊娠的重要激素；在胚胎着床过程中，孕激素是子宫内膜转化为分泌组织的必备因素，其有利于胚胎的黏附及维持黏附之后的蜕膜化反应[6]。孕激素的效应主要由PR介导，PR缺失的雌性小鼠表现为不孕，并在子宫和卵巢功能方面有着不同程度的缺陷。米非司酮作为PR的竞争性拮抗剂，能阻断孕激素的靶效应从而干扰着床。胚胎着床前期米非司酮的应用，可阻滞子宫内膜的发育，导致子宫内膜与胚胎发育不同步，而影响着床。在啮齿动物中，胚胎着床发生于怀孕的第4天傍晚至第5天凌晨[7]，此时子宫内膜在雌、孕激素等的调节下，发生一系列复杂而精密的变化，为胚胎植入创造适宜的微环境。大鼠妊娠第3天，发育良好的胚泡开始移行于子宫腔，此时皮下注射米非司酮可排除其对胚胎本身发育及输卵管运动的影响，较好地建立大鼠胚胎着床障碍动物模型[8]。此外，此模型可以较好地模仿IVF-ET过程中子宫内膜容受性低下的状态，为进一步探讨有关机制并寻求解决手段提供基础。

一般认为，IL-6家族细胞因子对于胚胎植入的意义重大[9]。STAT3是IL-6家族细胞因子活化的重要通路和中心环节，STAT3的活化能帮助提高子宫内膜容受性[10]。此外，有研究[11]表明，STAT3通过蛋白质-蛋白质的相互作用协同PR在胚胎着床中发挥重要作用。本研究着眼于PR及STAT3在胚胎着床中的作用，探讨补肾益气活血方对胚胎着床障碍大鼠子宫内膜PR及STAT3表达的影响，结果显示，模型组大鼠第8天子宫内膜PR及STAT3蛋白表达显著减少，提示米非司酮所致的大鼠胚胎着床障碍通过降低PR及STAT3蛋白表达而减少着床，而补肾益气活血方能显著增加子宫内膜PR及STAT3蛋白表达，促进基质细胞蜕膜化，从而促进胚胎着床。各组STAT3 mRNA表达虽无统计学差异(可能与样本数有限以及动物个体差异过大有关)，但模型组STAT3 mRNA含量低于其他三组，提示STAT3在促进胚胎着床、维持基质细胞蜕膜化中有着重要作用。模型组子宫内膜PR mRNA与正常组相比显著降低，这与文献[12]报道米非司酮能降低妊娠大鼠PR基因及蛋白的表达相一致。中药组与模型组相比PR mRNA有显著增加，而黄体酮组与模型组相比PR mRNA无统计学差异，提示补肾益气活血方可能存在其他途径改善子宫内膜PR基因表达。而补肾益气活血方能显著提高模型大鼠第8天子宫内膜PR的蛋白和mRNA表达，表明该方改善胚胎着床的效应与增加子宫内膜PR表达密切相关。

补肾益气活血方以补肾为立方之本，兼以益气、活血，其中桑寄生等补肾固冲之要药，有取自古方寿胎丸之意；另有丹参、当归活血养血，黄芪益气以生血，全方发挥补肾、益气、活血、安胎的功效。本实验结果发现，给予补肾益气活血方后，模型大鼠怀孕率及平均着床胚胎数均显著增加，子宫内膜发育趋于同步化，且血清孕酮水平、子宫内膜PR及STAT3表达显著提高，表明补肾益气活血方在一定程度能上提高子宫内膜PR及STAT3表达，改善子宫内膜容受性，促进胚泡成功着床。中药组与黄体酮组相比，怀孕率、平均着床胚胎数及子宫内膜PR及STAT3表达差异无统计学意义；中药组血清孕酮水平虽低于黄体酮组，但结合中药组的怀孕率及平均着床胚胎数可推测：补肾益气活血方可能不仅限于通过补充孕激素来改善胚胎着床。

综上，补肾益气活血方能改善大鼠胚胎着床及促进胚胎生长，其作用与改善子宫内膜PR及STAT3的表达密切相关，但二者的具体协同作用机理有待于进一步发掘证实。