竹节参多糖对对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤的保护作用

徐瑞,刘钊，付千，段欢，邓旭坤*

(1睢宁县人民医院 药剂科, 徐州221200 ; 2 中南民族大学 药学院, 武汉430074;3中南民族大学 学报编辑部, 武汉430074)

竹节参为五加科植物竹节参(PanarjaponicasC.A. Mey.)的干燥根茎[1].又名竹节三七、竹节人参、白三七，主要分布于长江以南，西起云南西部，东至日本，且存在狭叶竹节参、珠子参等变种[2,3].竹节参性温, 味甘、微苦, 归 肝、脾、肺经, 具有滋补强壮、散瘀止痛、止血、祛痰等功效[3].常用于肺痨咳血、跌扑损伤、咳嗽痰多、病后虚弱、虚劳咳嗽、咯血、倒经、崩漏、淤血闭经、跌打损伤、风湿关节痛[4].

对乙酰氨基酚(N-acetyl-para-aminophenol，APAP)，又名扑热息痛，是临床上常用的一种解热镇痛抗炎药[5]，同时也是最常见的可以引起肝毒性的药物[6]，对降低或缓解APAP诱导的肝损伤的研究一直是个热点课题.竹节参自古以来作为少数民族药材使用至今，在目前的研究中证明其皂苷成分有镇静、镇痛、保肝和抗溃疡作用[7,8]，此外，竹节参多糖类研究对竹节参的药理作用及药用价值展开也有广阔的研究前景，本课题从抗炎和抗氧化方面初步探究竹节参多糖对APAP诱导小鼠肝损伤的影响，以期为其合理应用提供依据.

1 材料与仪器

1.1 动物

SPF级昆明种雄性小鼠32只，体重约20～22 g，由湖北省疾病预防控制中心提供，实验动物生产许可号：SCXK(鄂)2017-0018，适应性喂养3 d后开始实验.

1.2 药材

竹节参药材购自安徽亳州药材市场，经中南民族大学药学院邓旭坤教授鉴定为五加科人参属植物竹节参的干燥根茎.

1.3 试剂

对乙酰氨基酚、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)检测试剂盒(上海源叶生物科技)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒、丙二醛(MDA)和微量还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒(南京建成)；无水乙醇、葡萄糖、硫酸、苯酚(国药集团化学试剂).

1.4 仪器

多功能酶标仪(SMP-R8，北京维德维康司)；电子天平(TX223L型，日本岛津)；紫外分光光度计(ZF-6型，上海嘉鹏).

2 实验方法

2.1 竹节参多糖的制备

取竹节参细粉，于95%乙醇中60 ℃回流3 h，脱脂.再加入80%乙醇60 ℃回流2 h，脱单糖和低聚糖.过滤，取药渣烘干，加入10倍量蒸馏水80 ℃热回流提取3次，每次2 h.合并3次滤液，减压浓缩滤液至适量体积，向收集的滤液中加入乙醇直至乙醇体积分数达到80%进行醇沉.4 ℃过夜，过滤收集沉淀并烘干，得到粗多糖.加入适量的热水使其溶解，除蛋白后流水透析48 h；透析液真空冷冻干燥，即得竹节参多糖(PSPJ).以葡萄糖为对照品, 用苯酚-硫酸法测得竹节参多糖中中性多糖的含量为70.61%；以葡萄糖醛酸为对照品, 用间羟基联苯法测得竹节参多糖中糖醛酸的含量为18.59%[9].

2.2 竹节参多糖中单糖组分分析

单糖对照品的衍生化：分别精密称取对照品鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、阿洛糖、半乳糖、甘露糖、肌醇10 mg于10个安瓿瓶中，再分别加入12 mg盐酸羟胺和0.5 mL吡啶，置于电热干燥箱中，90 ℃条件反应30 min，取出冷却至室温，再加入0.5 mL醋酐，90 ℃反应30 min，氮气吹干后，用1.0 mL氯仿溶解，备用[10].

竹节参多糖水解：精密称量竹节参多糖10 mg于安瓿瓶中，加入10 mL 3 mol/L的三氟乙酸，120 ℃水解6 h，室温冷却后用氮气吹干，得单糖，干燥保存备用.

竹节参多糖供试品制备：空白溶液处理方法亦如上.

气相色谱条件：载气为氮气(纯度为99.999 %)，氢气流量为50.0 mL·min-1；空气流量400 mL·min-1，氮气吹尾流量20.0 mL·min-1，恒定压力60.61 kPa，平均线速度34 cm·s-1；气化室温度240 ℃，检测器温度260 ℃，色谱柱初温140 ℃，维持3 min，以10 ℃/min升至240 ℃，保持11 min，分流比20∶1，进样量为1 μL[10].

2.3 实验动物的给药与造模

将小鼠随机分为对照组、模型组、竹节参多糖低(50 mg·kg-1)、中(100 mg·kg-1)、高(200 mg·kg-1)剂量组，分笼饲养.竹节参多糖组按剂量每日灌胃给药，持续灌胃7 d，对照组和模型组灌胃等体积生理盐水；除对照组外，最后一次给药2 h后，小鼠腹腔注射APAP(400 mg·kg-1)建立肝损伤模型.

2.4 样本的采集与处理

观察并记录小鼠24 h内的生存情况，取血后立即解剖，肝脏称重并记录，取少量肝脏于甲醛固定液中，用于HE染色；剩余肝脏放入-80 ℃保存用于生化分析.

2.5 肝组织病理形态学检查

将固定好的肝组织进行石蜡包埋，并切成厚度4～5 μm的切片.按标准的HE染色步骤进行操作，显微镜下观察、拍照.

2.6 相关指标的检测

按照试剂盒说明书检测血清和肝脏中ALT、AST、LDH、GSH和MDA的水平，按ELISA试剂盒说明书检测小鼠血清中IL-6和IL-1β的含量.

2.7 统计学分析

3 结果与分析

3.1 竹节参多糖组分分析

根据出峰时间确定单糖的成分组成，通过峰面积归一化法计算各个单糖的相对质量分数.按照项“2.2”的色谱条件，将10种对照品的单糖衍生物以及混合物分别进样，记录各个单糖样品的保留时间和峰位置，最后将空白溶液和供试品溶液分别进样，记录色谱图.通过面积归一化法进行计算多糖成分中各单糖的组分.结果如图1，单糖的质量分数结果见表1.

1)鼠李糖；2)半乳糖；3)阿拉伯糖；4)木糖；5)果糖；6)甘露糖；7)葡糖糖醛酸；8)半乳糖醛酸；9)葡萄糖；10)核糖a)混合标准品；b)竹节参多糖图1 竹节参多糖样品和标准品气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of PSPJ sample and standards

表1 竹节参多糖中各单糖组分的质量分数Tab.1 Mass fraction of monosaccharide components in PSPJ

由图表可知竹节参多糖主要由葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡糖糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等构成，其质量分数百分比分别为53.41%、25.02%、13.62%、5.03%、1.10%、0.99%、0.82%.

3.2 竹节参多糖对肝损伤小鼠生存率的影响

竹节参多糖对肝损伤小鼠生存率的影响结果见图2.如图2所示，模型组小鼠的24 h生存率为20%，而低、中、高剂量组中小鼠生存率均有显著提高(P<0.05或P<0.01)，中剂量给药组小鼠24 h生存率升高到60%(P<0.01).说明竹节参多糖能显著提高APAP诱导的肝损伤小鼠的生存率.

图2 竹节参多糖对小鼠生存率的影响Fig.2 Effect of PSPJ on survival rate of mice

3.3 节参多糖对肝损伤小鼠肝功能的影响

肝脏指数可以间接反映肝脏的受损程度，而血清中AST、ALT和LDH水平能直接反映肝功能. 节参多糖对肝损伤小鼠肝功能的影响结果如下表2和图3所示，与对照组比较，模型组的肝指数、血清AST、ALT和LDH水平显著升高(P<0.01或P<0.001)，显示建模成功；与模型组相比，PSPJ给药组均使得肝指数、血清AST、ALT和LDH有不同程度的下降(P<0.05或P<0.01)，且中剂量PSPJ对APAP诱导的肝损伤有更好的减缓效应(P<0.01).

表2 竹节参多糖对APAP诱导肝损伤小鼠肝指数的影响Tab.2 Effects of PSPJ on liver index of APAP-induced liver injury in mice

与对照组比较，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05, **P<0.01图3 竹节参多糖对小鼠肝功能的影响Fig.3 Effect of PSPJ on liver function in mice

3.4 竹节参多糖对肝损伤小鼠肝组织GSH和MDA的影响

抗氧化因子GSH和氧化应激标志物MDA可以反映机体的氧化应激状态，竹节参多糖对肝损伤小鼠肝组织GSH和MDA的影响结果见图4.

与对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01图4 竹节参多糖对小鼠肝脏GSH和MDA含量的影响Fig.4 Effects of PSPJ on hepatic lever of GSH and MDA in mice

如图4所示，与对照组比较，模型组GSH显著下降，而MDA显著升高(P< 0.01)；与模型组比较，给PSPJ后，小鼠肝组织中的GSH水平明显增高， MDA 的水平明显降低(P<0.05或P<0.01).

3.5 竹节参多糖对肝损伤小鼠炎症因子的影响

IL-1β和IL-6因子在APAP诱导肝损伤发生发展上有重要作用，APAP诱导产生的IL-1β可导致肝细胞加剧损伤以致死亡，竹节参多糖对肝损伤小鼠炎症因子的影响结果见图5.

与对照组比较, ###P<0.001；与模型组比较, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001图5 竹节参多糖对小鼠血清炎症因子的影响Fig.5 Effect of PSPJ on serum inflammatory factorsin mice

如图5所示，与对照组比较，模型组中IL-1β和IL-6因子显著升高(P< 0.001)；与模型组比较，PSPJ给药组均能使IL-1β和IL-6不同程度的下降，且显示PSPJ对APAP诱导产生IL-1β炎症因子具有更好的抑制作用(P<0.01或P<0.001).

3.6 竹节参多糖对肝损伤小鼠病理学影响

如图6所示，对照组小鼠肝细胞整齐排列，结构完整，细胞核位于细胞中央.与对照组比较，APAP 模型组小鼠肝组织有明显的出血，细胞排列紊乱，并伴有大量的炎性细胞.而与APAP组比较，PSPJ给药组小鼠肝脏出血明显减少，炎性细胞浸润减少等，且PSPJ中剂量改善效果较为显著.

图6 竹节参多糖对小鼠肝组织病理变化的影响Fig.6 Effect of PSPJ on the pathological changes of liver in mice

4 讨论

肝脏是人体最大的免疫器官，也是最主要的代谢器官，是保证机体健康的重要器官[3].APAP在临床上的广泛使用，使得其诱导肝细胞损伤的几率和范围显著上升.竹节参多糖的作用研究越来越广泛，它对抗肿瘤、抗衰老、降血脂等都有良好的作用.

多糖类成分结构复杂，种类多样，本文在提取竹节参多糖时采用60 ℃，有利于保护对热不稳定的成分.将得到的粗多糖反复透析，用苯酚-硫酸法测得其中性多糖的含量为70.61%，用间羟基联苯法测得其糖醛酸的含量为18.59%，气相色谱分析其组成为：葡萄糖(53.41%)、半乳糖醛酸(25.02%)、半乳糖(13.62%)、葡糖糖醛酸(5.03%)、鼠李糖(1.10%)、阿拉伯糖(0.99%)、木糖(0.82%)等，为竹节参多糖的药理学研究奠定物质基础.

ALT、AST、LDH水平能反应肝细胞损伤的情况.本文中竹节参多糖能够有效降低小鼠肝脏和血清LDH，反应药物在一定程度上对肝细胞损伤有保护作用.ALT能反应肝细胞的急性损伤，AST则反应肝细胞的损伤程度，在使用竹节参多糖的情况下，ALT与AST数值均有降低，说明竹节参多糖不仅能够有效减缓肝细胞损伤的情况，又对肝损伤细胞的修复有良好作用.

肝细胞中释放的IL-1β与IL-6在一系列炎症反应中发挥着至关重要的作用. IL-1β促炎因子能够使肝细胞的炎症反应延长和加剧，进一步损伤肝细胞；而IL-6能够使肝细胞再生和修复.在本实验中，竹节参多糖能够抑制有效抑制促炎介质IL-1β浓度，并且对IL-6的浓度无显著影响，说明竹节参多糖对APAP诱导的肝损伤细胞有减轻作用，还能保证受损肝细胞的修复再生.另外，竹节参多糖有效提高了APAP诱导肝损伤小鼠的生存率并且缓解小鼠肝脏的病理学变化.本文首次证明竹节参多糖能够有效缓解对APAP 诱导的小鼠急性肝损伤，可能是通过抗氧化和抗炎机制来发挥疗效，并为竹节参的进一步研究提供了可能的依据.