白鲜碱对气管平滑肌的舒张作用及机理研究

沈金花，韩淑慧，时顺波

(中南民族大学 生命科学学院，医学生物研究所&武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074)

哮喘是一种慢性炎症性疾病，由基因和环境相互作用引起的，其发病机制尚不完全清楚[1].哮喘会引起气短、胸闷和咳嗽等症状，这些症状与可变的呼气气流有关，即由于支气管收缩(气道狭窄)、气道壁增厚和黏液增多而导致肺部呼吸困难[2].通过适当的ICS治疗或ICS/LABA治疗，可以减少哮喘恶化的频率，但并能完全阻止[3]，且哮喘长期治疗成本高，容易对药物产生抗性，所以其它治疗哮喘的生物制剂正在研究中.

白鲜碱(dictamnine)是一种具有多种生物活性的小分子生物碱，可从多种植物中提取，也可以人工合成(分子结构见图1).已证明它具有多种生物学功能，包括抗炎、抗真菌、抗血管生成和抗癌活性[4].但目前其在气管平滑肌的作用尚未见报道，故本文通过使用高钾(H-K)和乙酰胆碱(ACh)预收缩的气管平滑肌，探究白鲜碱是否具有舒张气管平滑肌的异常收缩和扩张气管的作用.

图1 白鲜碱分子结构Fig.1 Molecular structure of dictamnine

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

白鲜碱(上海源叶生物科技有限公司)；乙酰胆碱(ACh)、硝苯地平、Pyr3、GdCl3、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)(美国Sigma).

高钙溶液、高钾溶液、细胞外液、电极内液、酶溶液Ⅰ和酶溶液Ⅱ，按参考文献[6]配制.

BABL/c小鼠，雄性，SPF级，6～8周龄，购自湖北省疾病预防控制中心.在控温、控湿条件下，自由饮水进食.动物实验和处理均遵照《中南民族大学实验动物使用与福利指导手册》.

离体组织器官恒温灌流系统(HV-4，成都泰盟软件有限公司)；生物机能实验系统(BL-420S，成都泰盟软件有限公司)；张力换能器(JH-2，航天医学工程研究所)；膜片钳放大器(HEKA，EPC-10，德国Lambrecht)；玻璃微电极(外径1.4 mm，南京泉水教学实验器材厂).

1.2 小鼠离体气管环的处理

断颈法处死小鼠，完整取出主气管和肺置于含预冷的PSS溶液的解剖盘中，在体式显微镜下剪去气管周围的组织.在靠近三角区处取适当长度的气管，插入两个三角环，一个固定，一个与张力换能器相连，将气管置于含6 mL PSS溶液的水浴槽中，37 ℃温浴，持续通氧.调前负荷为300 mg，每15 min换一次PSS溶液并再次调前负荷，共4次平衡.平衡60 min后加入80 mmol·L-1KCl或100 μmol·L-1ACh预刺激气管，当气管充分收缩后洗脱恢复至基线，待气管休息30 min后开始实验[5].药物引起的舒张作用以气管异常收缩的百分比(均数±SEM)表示.

1.3 小鼠气管平滑肌细胞的制备

断颈法处死小鼠，快速取出主气管和肺置于含预冷的rTASM解离液的解剖盘中，分离出主气管及支气管后，沿肌条与软骨环的连接处剪开，去除软骨组织得到干净的肌条.将肌条放入37 ℃预热10 min的酶溶液Ⅰ中消化22 min，然后将肌条转入预热的酶溶液Ⅱ中消化8 min.将肌条清洗2次，转入含300 μL BSA的离心管中，小心打散后置于冰上备用.

1.4 全细胞电流记录

通过膜片钳放大器检测全细胞VDCCs电流.前置电压为-70 mV，维持50 ms，给予细胞去极化阶段刺激500 ms，刺激电压从-70 mV逐渐增加至+40 mV，每10 s增加10 mV.通过PatchMaster软件分析电流信号，Origin 8分析作图[6].

2 结果与分析

2.1 白鲜碱对高钾预收缩的气管环的舒张作用

肌细胞的收缩与胞质内Ca2+浓度有关.使用80 mmol·L-1KCl诱发气管平滑肌细胞的电压依赖性钙离子通道(VDCCs)通道开放，使气管平滑肌痉挛，气管环异常收缩[7].白鲜碱能成剂量依赖性地抑制这种异常收缩(图2a，2b).

a) 白鲜碱剂量依赖的抑制高钾预收缩的气管环; b) 白鲜碱抑制高钾预收缩的气管环的量效曲线(n=6);c) 10 μmol·L-1 硝苯地平完全阻断高钾引起的气管环收缩;d) 白鲜碱对静息气管环无影响图2 白鲜碱对高钾预收缩的气管环的舒张作用Fig.2 Relaxation effect of dictamnine on high K+ pre-contracted tracheal ring

其最大舒张值为(93.72±1.06)%，收缩被抑制一半时的浓度(IC50)为(51.6±1.02)%.硝苯地平(nifedipine)是一种VDCCs的选择性阻断剂，10 μmol·L-1硝苯地平可以完全阻断80 mmol·L-1KCl诱导的气管收缩(图2c).白鲜碱对静息条件下的气管张力无影响(图2d).

2.2 白鲜碱抑制高钾引起的外钙内流

当细胞外无Ca2+存在的情况下，高钾不能引起气管的收缩，当细胞外补充Ca2+后，可以立即引发气管收缩，113 μmol·L-1白鲜碱可抑制此收缩(图3a).提前孵育113 μmol·L-1白鲜碱，细胞外补充Ca2+后引起的收缩反应被抑制(图3b)，说明它对高钾预收缩的气管环的舒张作用是通过抑制VDCCs通道介导的Ca2+内流来产生的.

a) 无外钙条件下高钾不引起气管收缩;b) 孵育白鲜碱抑制外钙内流引起的气管收缩图3 白鲜碱抑制高钾引起的外钙内流Fig.3 Inhibitiory effect of dictamnine on Ca2+ influx evoked by high K+

2.3 白鲜碱阻断VDCCs电流

用全细胞模式记录单个气管平滑肌细胞的VDCCs电流，与对照组相比加入10 μmol·L-1硝苯地平或316 μmol·L-1白鲜碱抑制了VDCCs电流(图4a)，当电压为10 mV时得到最大激活电流(图4b)，该电流能被10 μmol·L-1硝苯地平和316 μmol·L-1白鲜碱完全阻断.表明白鲜碱可能发挥类似硝苯地平的作用，抑制VDCCs电流，可通过阻断VDCCs，降低细胞内Ca2+水平来缓解高钾诱导的气管平滑肌收缩.

a) 白鲜碱对气管平滑肌细胞的VDCCs时间-电流图;b) 白鲜碱对气管平滑肌细胞的VDCCs电压-电流图图4 白鲜碱阻断VDCCs电流的作用Fig.4 Inhibitiory effect of VDCCs currents blocked by dictamnine

2.4 白鲜碱对ACh预收缩的气管环的舒张作用

细胞内Ca2+的调控除VDCCs外，还有多种离子通道参与.乙酰胆碱(ACh)是哮喘研究常用的诱发剂，它能激活电压依赖性钙离子通道(VDCCs)和非选择性阳离子通道(NSCCs)[8,9].由ACh引起的气管异常收缩也能被白鲜碱剂量依赖性地抑制(图5)，其最大舒张值为(89.47±3.17)%，收缩被抑制一半时的浓度(IC50)为(190.11±1.02)%.

当使用VDCCs的选择性抑制剂硝苯地平排除VDCCs对气管收缩的影响后，白鲜碱依然可以通过剂量依赖地抑制NSCCs来舒张气管环(图6a，6b).硝苯地平抑制VDCCs使气管平滑肌细胞中Ca2+浓度降低，产生(11.43±3.73)%的舒张作用.190 μmol·L-1白鲜碱可以舒张余下的(74.68±7.99)%(图6c,6d).提示了白鲜碱不仅抑制由VDCCs介导的Ca2+内流，还作用于其他通道，使ACh刺激的气管环舒张.

a,b) 排除VDCCs后白鲜碱对ACh预收缩的气管环的量效曲线(n=6);c,d) 白鲜碱对排除VDCCs后的气管环的影响(n=6)图6 排除VDCCs通道后白鲜碱对气管环的舒张作用Fig.6 Relaxation effect of dictamnine on tracheal ring without VDCCs

2.5 白鲜碱抑制ACh引起的内钙释放

在细胞外无Ca2+的条件下，加入ACh会引起一个瞬时收缩，这是由于肌质网中的Ca2+进入细胞质中，使细胞质Ca2+浓度增加，气管平滑肌细胞收缩.当细胞外补充Ca2+后，细胞外Ca2+流入细胞质，引起一个持续稳定的收缩，这种收缩可被190 μmol·L-1白鲜碱部分抑制(图7a).当提前孵育190 μmol·L-1白鲜碱时，由内钙释放所引起的瞬时收缩被抑制，而补充细胞外Ca2+后，外钙内流引起的收缩也被部分抑制(图7b).当排除VDCCs后，190 μmol·L-1白鲜碱对外钙内流引起的持续稳定收缩产生了更大的舒张作用(图7c).白鲜碱对内Ca2+释放引起的气管收缩抑制效果与硝苯地平相似(图7d)，说明白鲜碱可抑制气管平滑肌细胞肌质网的Ca2+释放.

a,b) 白鲜碱抑制ACh引起的内钙外流;c,d) 排除VDCCs后白鲜碱对ACh预收缩的气管的影响图7 白鲜碱对ACh引起的内钙释放的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of dictamnine on the release of intracellular calcium induced by ACh

2.6 白鲜碱抑制Na+/Ca2+交换

除了VDCCs和NSCCs通道之外，Na+/Ca2+交换(NCX)也是调节Ca2+内流的一类重要通道[10].NCX通过作用于膜蛋白并促进离子通过膜，产生电压变化和随后的去极化来激活信号传导途径.在含Na+的正常PSS中，加入100 μmol·L-1ACh会引起气管持续稳定的收缩，再加入190 μmol·L-1白鲜碱能抑制这种收缩(图8a).将正常PSS溶液中的Na+用Li+替换掉，气管的基础张力有所上升，加入100 μmol·L-1ACh后仍然有一定的收缩，加入190 μmol·L-1白鲜碱后，气管舒张至基础张力以下(图8b).两组实验对比，可发现基础值、收缩值和舒张值都具有显著差异，P<0.01.阐明Na+/Ca2+交换在ACh刺激下参与细胞内钙浓度升高的机制，白鲜碱能抑制Na+/Ca2+交换.

a) 白鲜碱抑制ACh引起的收缩;b) 白鲜碱抑制Na+/Ca2+交换;c) 正常条件下与Na+/Ca2+交换的对比图图8 白鲜碱对Na+/Ca2+交换的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of dictamnine on Na+/Ca2+ exchange

2.7 白鲜碱对组织活性的影响

为了研究药物的刺激对气管的张力的影响，在白鲜碱抑制气管舒张后停药.结果表明由高钾再刺激的气管收缩值可以完全恢复(图9a，9b).而由ACh再刺激的气管收缩值为(54.14±2.62)%，与白鲜碱作用之前相比有明显差异(图9c，9d).说明白鲜碱可以舒张预收缩的气管，虽然对VDCCs通道无影响，但对ACh激活的其他通道的正常生理活性有影响，也有可能是瞬时的洗脱药物不能完全洗掉，因此气管的再收缩力不及药物处理之前那么大.

a,b) 白鲜碱对高钾预刺激的组织活性的影响; c,d) 白鲜碱对ACh预刺激的组织活性的影响图9 白鲜碱对组织活性的影响Fig.9 Effect of dictamnine on tissue activity

3 讨论

气道高反应性(AHR)和炎症是哮喘的关键病理生理学特征.气管平滑肌的增强收缩是AHR的原因之一[11].而气道平滑肌细胞内Ca2+的动态变化发挥了重大作用[12]，这和质膜及肌质网上的各种离子通道的活性有关[13].

在体外常用高钾溶液和ACh模拟哮喘发病时气管平滑肌痉挛状态.首先使用高钾打开气管平滑肌上的VDCCs通道，引起细胞外钙内流，气管平滑肌收缩.结果表明白鲜碱可以剂量依赖性地抑制VDCCs通道，最大舒张值为(93.72±1.06)%，这依赖于抑制了细胞外钙内流.而单细胞离子通道检验证明白鲜碱完全阻断VDCCs电流，效果和VDCCs的选择性抑制剂硝苯地平相似.接着使用ACh打开气管平滑肌上的VDCCs和NSCCs等离子通道，使气管平滑肌细胞去极化，通过细胞外钙内流和肌质网中Ca2+释放两方面引起气管平滑肌收缩[14].结果表明白鲜碱可以剂量依赖性地抑制ACh引起的气管收缩，最大舒张值为(89.47±3.17)%，不仅影响Ca2+内流还影响肌质网中Ca2+释放.且白鲜碱除了抑制VDCCs通道外，还抑制了其他与Ca2+流入有关的通道，可能与瞬时受体电位TRP通道有关，并对Na+/Ca2+交换(NCX)通道有抑制作用.

白鲜碱具有许多有益的生物活性，如抗血小板聚集，抗高血压，抗菌，抗有丝分裂，抗真菌，血管舒张等[15].本文实验证明白鲜碱具有舒张气管平滑肌异常收缩，扩张气管的作用，有望作为钙离子拮抗剂抑制气道高反应，缓解哮喘.