中间苍白杆菌SCUEC4菌株中尼古丁降解相关ocnC基因的克隆与表达

夏珍珍，姚家成，黄粤，冯喆，赵新颖，李晓华

(中南民族大学 生命科学学院, 微生物资源与利用湖北省工程技术研究中心/生物技术国家民委重点实验室，武汉 430074)

尼古丁，又称烟碱，是一种存在于茄科植物中的天然生物碱[1]，在烟草中含量最为丰富.尼古丁是由一个吡啶环和一个四氢吡咯环组成的有毒氮杂环化合物，结构稳定，易溶于水、乙醇等溶剂，在自然环境中难以降解.在烟草种植及烟草生产中产生的尼古丁会随着雨水渗透到地下，污染水体[2].在吸烟人群中，尼古丁是引起上瘾的主要物质[3]，长期摄入，对人体会造成心脑血管疾病，甚至是致癌、致畸[4,5]等.欧盟标准规定尼古丁质量浓度超过500 mg·kg-1的烟草废弃物为“有毒有害物质”[6].因此，使用尼古丁降解微生物来降低尼古丁的危害是目前高效率且经济环保的方法[7].目前，已发现及鉴定了很多尼古丁降解菌株，主要是假单胞菌属(PseudomonasputidaS16[8]、Pseudomonassp. strain HZN6[9])、节杆菌属(ArthrobacternicotinoboranpAO1[10])，土壤农杆菌属(Agrobacteriumtumefaciensstrain S33[11])，Shinella属(Shinellasp. HZN7[12])，中间苍白杆菌属(O.intermedium[13])等菌株.

中间苍白杆菌SCUEC4菌株[14]中的ocnC基因通过测序获得的核酸序列进行在线比对，发现与中间苍白杆菌SJY1[13]菌株vppC基因和根癌土壤杆菌SCUEC1[15,16]菌株中agnC基因具有同源性，推断ocnC基因编码醛脱氢酶，能够催化4-(6-羟基吡啶-3-基)-4-氧代丁醛转化为6-羟基-3-琥珀酰吡啶[17].本研究对中间苍白杆菌SCUEC4菌株中的ocnC基因进行克隆，构建重组质粒并将其转化至E.coliBL21(DE3)异源表达，对OcnC蛋白进行诱导表达条件优化，这为阐明中间苍白菌SCUEC4菌株中完整的尼古代谢途径、ocnC基因的功能以及醛脱氢酶的工业化应用奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

EscherichiacoliBL21(DE3) 菌株、原核表达载体pET28a(+)、中间苍白杆菌SCUEC4菌株保藏自中南民族大学生命科学学院微生物实验室.

1.2 培养基

LB液体培养基(g·L-1)配方：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸膏5.0 g，氯化钠10.0 g，加蒸馏水定容到1000 mL，pH 7.0. 固体培养基中添加琼脂 18.0 g.

1.3 ocnC基因克隆和重组质粒pET28a(+)-ocnC的构建

使用提取总DNA试剂盒(TaKaRa Mini BEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)，获得中间苍白杆菌SCUEC4菌株总DNA. 根据中间苍白杆菌SCUEC4菌株全基因组测序中ocnC基因的核酸序列和质粒载体pET28a(+)上的多克隆位点，引物设计软件为Primer Premier 5.0.

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

通过PCR反应克隆基因片段.ocnC基因PCR反应体系：SCUEC4菌株总DNA 1.0 μL，上游引物Primer-F 1.0 μL，下游引物Primer-R 1.0 μL，MIX (green，擎科金牌)22.0 μL，总体积为25.0 μL.PCR反应程序条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃保温，停止程序.将PCR目的片段回收纯化，经SacI与Hind III双酶切后再回收，与同样双酶切回收后的载体pET28a(+)使用T4连接酶进行连接，将其转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3).挑取Kan抗性平板中的单菌落，提取质粒，再次使用SacI与Hind III双酶切验证鉴定，将酶切鉴定正确的菌液进行DNA测序验证，分析序列结果.

1.4 ocnC基因的原核表达与条件优化

将测序鉴定正确的pET28a(+)-ocnC重组质粒转化菌株在LB培养基中进行扩大培养，在25 mL菌液中加入100 mmol·L-1异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2 mmol·L-1，16 ℃下诱导表达20 h.将诱导表达的菌液离心，弃上清，收集菌体，加入 4 mL裂解液重悬菌体，超声破碎 15 min (超声1 s，间隔 2 s).4 ℃，4000 r·min-1离心10 min，分别收集全菌液、上清液及沉淀.使用12%的分离胶和5%的浓缩胶配方制备的SDS-PAGE凝胶检测，电压为90～110 V.

设置不同的IPTG浓度、诱导温度以及诱导时间对ocnC进行诱导表达以获得较佳的诱导表达条件.在温度设置为16 ℃，诱导表达时间为20 h时，将IPTG终浓度设置为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1，对pET28a(+)-ocnC重组质粒转化菌株进行诱导表达，通过SDS-PAGE凝胶检测方法，分析IPTG诱导浓度的较佳条件.在0.2 mmol·L-1IPTG浓度下，诱导表达时间为20 h，将诱导温度分别设置为16、20、25、30、37 ℃，通过SDS-PAGE凝胶检测方法，分析较佳的诱导温度条件.在诱导温度为16 ℃和IPTG浓度为 0.2 mmol·L-1条件下，分别将诱导时间设置为10、15、20、25、30、35、40 h，采用SDS-PAGE凝胶检测分析表达量较高的诱导时间.

1.5 ocnC基因编码的氨基酸生物信息学分析

使用NCBI中BLAST在线比对软件对OcnC氨基酸序列检索，寻找相似度高的氨基酸序列，通过 Clustal X软件对OcnC氨基酸序列的同源性进行比对分析.采用MEGA7.0软件，以N-J法，Bootstrap值为1000，对OcnC氨基酸序列进行系统进化树构建，预测同源序列关系.使用BioEdit软件和ExPASy ProtParam在线软件预测OcnC氨基酸序列的蛋白质理化性质；采用PROSITE软件及NCBI BLASTp在线软件进行氨基酸保守结构域(CD)的预测；利用Phyre2及 PredictProtein在线预测蛋白质的二级结构及三级结构.

2 结果与分析

2.1 ocnC基因的克隆与重组质粒pET28a(+)-ocnC的构建

以中间苍白杆菌SCUEC4菌株总DNA为模板，对目的基因进行PCR扩增，获得一段大小约为1.3 kb的片段与SCUEC4菌株全基因组测序中ocnC基因大小一致(图1).

M)DL2000；1) ocnC DNA片段图1 ocnC PCR基因扩增片段Fig.1 PCR amplification of ocnC gene

将PCR扩增片段回收纯化，双酶切后与载体 pET28a (+)质粒连接，将连接产物转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)后，提取转化子的质粒，使用SacI和Hind III双酶切验证.通过DNA凝胶结果分析，质粒双酶切后得到2个片段，分别对应1.3 kb处的ocnC基因双酶切片段和5.3 kb处的pET8a(+)质粒双酶切片段(图2).将验证正确的菌液进行DNA序列测定，获得核酸序列并且与ocnC基因一致.

M1)λ-Hind III DNA；1) pET28a(+)；2) pET28a(+)-ocnC DNA；3) ocnC DNA；M2) DL2000图2 重组质粒pET28a(+)-ocnC的构建Fig.2 Construction of recombinant plasmid pET28a(+)-ocnC

2.2 OcnC蛋白氨基酸序列分析

利用NCBI BLASTp在线软件和MEGA7.0软件，将OcnC蛋白氨基酸序列及其相似度较高的氨基酸序列进行比对分析，构建OcnC蛋白系统进化树(图3).由图3可知，OcnC蛋白的氨基酸序列与根癌土壤杆菌SCUEC1中的agnC基因具有80.8%的相似度，与Ochrobactrumsp. SJY1 中的醛脱氢酶具有81%的相似性.Ochrobactrumsp. SJY1中的醛脱氢酶能够催化4-(6-羟基吡啶-3-基)-4-氧代丁醛转化为6-羟基-3-琥珀酰吡啶[13].

根据ProtParam在线分析蛋白理化性质得出：OcnC蛋白含有447个氨基酸，理论分子量为48.0 kDa，pI为4.99；带负电荷(Asp+Glu)和带正电荷(Arg+Lys)的氨基酸残基数分别为57个和42个；分子式为C2138H3386N588O645S12；脂肪指数值为95.06，不稳定指数值为30.39；平均亲水系数值(GRVAY)为0.038. 采用PROSITE、NCBI BLASTp在线对保守结构域(CD)进行预测，OcnC蛋白属于醛脱氢酶家族蛋白. 通过Phyre2和 PredictProtein在线预测OcnC蛋白的二级结构及三级结构，其中α-螺旋占46.98%，β-折叠占11.63%.

根据以上理化性质的数值分析，由于OcnC蛋白的不稳定指数值小于阈值40，可知OcnC蛋白为稳定蛋白.由于其带负电荷氨基酸数大于带正电荷氨基酸数，可推断OcnC蛋白为酸性蛋白质.根据OcnC蛋白的平均亲水系数值(GRVAY)推测可知，OcnC蛋白属于疏水性蛋白.利用SignalP 4.1 Server在线软件，预测OcnC蛋白中无信号肽序列，推测OcnC蛋白属于非分泌性蛋白.

图3 OcnC蛋白氨基酸序列的系统进化树Fig.3 Phylogetic tree of OcnC protein amino acid sequence

2.3 ocnC基因在大肠杆菌中异源表达

在16 ℃,0.2 mmol·L-1IPTG的诱导表达条件下, 将pET28a(+)-ocnC重组质粒转化菌株培养20 h.分别吸取菌液、沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳，结果如图4所示.与对照含pET28a(+)质粒E.coliBL21(DE3)菌株对比，在40.0～55.0 kDa之间有OcnC蛋白的表达. 沉淀中OcnC蛋白浓度较高，上清中OcnC蛋白浓度较少.

M)蛋白Marker；1) 含pET28a(+)质粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液；2～4) 含pET28a(+)-ocnC重组质粒E. coli BL21(DE3)菌株的裂解混合液、上清液和沉淀图4 E. coli BL21(DE3)中OcnC蛋白的表达分析Fig.4 Analysis of the OcnC protein expression in E. coliBL21(DE3)

2.4 不同浓度IPTG对OcnC蛋白表达量的影响

将IPTG浓度分别设置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1，对含pET28a(+)-ocnC重组质粒的BL21(DE3)菌株于16 ℃进行诱导表达20 h. SDS-PAGE电泳结果(图5)与含pET28a(+)质粒的E.coliBL21(DE3)菌株裂解混合液的对照组相比，在不同浓度IPTG的诱导条件时，含pET28a(+)-ocnC重组质粒的E.coliBL21(DE3)菌株裂解混合液，在40.0～55.0 kDa之间有OcnC蛋白的表达，IPTG浓度在0.2 ～1.0 mmol·L-1范围内，随着IPTG浓度增加，OcnC蛋白量呈上升趋势，在浓度1.0 ～1.2 mmol·L-1范围内，随着IPTG浓度增加，OcnC蛋白量呈下降趋势，表明OcnC蛋白表达量较高的IPTG浓度为1.0 mmol·L-1.

M)蛋白 Marker；1) 含pET28a(+)质粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液；2～7) 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1 IPTG浓度诱导含pET28a(+)-ocnC重组质粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液图5 OcnC蛋白在不同IPTG浓度表达量的差异Fig.5 Difference of OcnC protein expression at different IPTG concentrations

2.5 不同诱导表达温度对OcnC蛋白表达量的影响

在IPTG浓度为0.2 mmol·L-1条件下，将诱导温度分别设置为16、20、25、30、37 ℃.对含pET28a(+)-ocnC重组质粒转化的BL21(DE3)菌株进行诱导表达20 h. 通过SDS-PAGE电泳分析结果，如图6所示，与含pET28a(+)质粒的E.coliBL21(DE3)菌株裂解混合液的对照组相比，在不同的诱导温度条件时，含pET28a(+)-ocnC 重组质粒的E.coliBL21(DE3)菌株裂解混合液，在40.0～55.0 kDa之间有大量OcnC蛋白，在16～37 ℃的诱导温度范围内，随着温度的升高，OcnC蛋白量逐渐增加，表明OcnC蛋白表达量较高的温度在37 ℃.

M)蛋白Marker；1)含pET28a(+)质粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液； 2～6)16、 20、 25、 30、 37℃下含pET28a(+)-ocnC重组质粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液图6 OcnC蛋白在不同诱导温度表达量的差异Fig.6 Difference of OcnC protein expression at different induction temperatures

2.6 不同诱导表达时间对OcnC蛋白表达量的影响

在16 ℃，IPTG诱导浓度为0.2 mmol·L-1的条件时，分别将诱导表达时间设置为10、15、20、25、30、35、40 h，对含pET28a(+)-ocnC重组质粒转化的BL21(DE3)菌株进行诱导表达，通过SDS-PAGE电泳检测结果(图7)，以含有pET28a(+)质粒的BL21(DE3)菌株为对照组，在不同的诱导表达时间中，含pET28a(+)-ocnC重组质粒的E.coliBL21(DE3)菌株，在40.0～55.0 kDa之间存在大量的OcnC蛋白.由图7可知，诱导表达时间在10～20 h时，随着诱导时间的增加，OcnC蛋白的表达量在增加；在20～40 h的诱导时间范围内，OcnC蛋白表达量呈下降趋势，表明OcnC蛋白表达量较高的的时间为20 h.

M) 蛋白Marker；1) 含pET28a(+)质粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液；2～8)诱导10、15、20、25、30、35、40 h下含pET28a(+)-ocnC重组质粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液图7 OcnC蛋白在不同诱导时间表达量的差异Fig.7 Difference of OcnC protein expression at different induction times

3 讨论

本研究对中间苍白杆菌SCUEC4菌株中与尼古丁降解相关的ocnC基因进行克隆和表达，并对OcnC蛋白的表达条件进行优化.以中间苍白杆菌SCUEC4菌株的总DNA为模板，通过PCR扩增得到长为1344 bp的基因片段，并对ocnC基因编码的氨基酸序列进行生物学分析，可知ocnC表达蛋白大小为48.0 kDa，pI为4.99，OcnC蛋白为非分泌性疏水性蛋白.成功构建pET28a(+)-ocnC重组质粒，转化至BL21(DE3)菌株进行异源表达.通过SDS-PAGE检测，发现在IPTG浓度为1.0 mmol·L-1，诱导温度在37 ℃，诱导时间为20 h时，有较高表达量的OcnC蛋白，且大部分分布在沉淀中.

将ocnC基因测序结果在NCBI中比对发现，ocnC基因与中间苍白杆菌SJYI中的相关基因相似性有81.1%，ocnC基因核酸序列与本实验室的根癌土壤杆菌SCUEC1中的agnC基因的核酸序列具有80.8%的相似度.推测ocnC基因编码的是醛脱氢酶，在醛脱氢酶[18]家族未发现有100%相似的相关基因，进一步对OcnC蛋白的结构及功能研究，以增加醛脱氢酶家族的多样性.

根据文献报道预测的尼古丁降解代谢相关基因[13,15-17]中，ocnC基因编码的酶能够将4-(6-羟基吡啶-3-基)-4-氧代丁醛氧化为6-羟基-3-琥珀酰吡啶，其中6-羟基-假氧化尼古丁通过氧化脱氨基反应，生成甲胺和4-(4-羟基苯基)-4-氧代丁醛，6-羟基-3-琥珀酰吡啶可经过6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶催化单加氧反应生成2,5-二羟基吡啶. 由于其代谢途径中的中间产物没有被完全发现，可能还存在着许多其它的尼古丁降解菌及其代谢途径没有被研究.因此，对于尼古丁降解菌的降解途径、降解基因以及相关的酶仍需更加深入的研究.