基于磁珠富集法开发的15个三角鲂多态性微卫星标记的特性分析

刘凯，谢楠，冯晓宇，马恒甲

(杭州市农业科学研究院 水产研究所，浙江 杭州 310024)

三角鲂(Megalobramaterminalis)，隶属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鲌亚科(Culterinae)、鲂属(Megalobrama)，分布于中国岭南以北各大水系[1]。由于过度捕捞及生态环境变化，三角鲂野生资源量严重下降。钱塘江流域由于地方对三角鲂种质资源保护、增殖放流等工作的开展，拥有一定的资源量，且建有全国唯一的国家级三角鲂原种场[2]。

有关三角鲂的遗传数据较少，因此开展遗传研究对保护三角鲂至关重要。微卫星是高多态性的共显性分子标记，是鱼类遗传多样性研究的理想分子标记[3-5]。有学者将从团头鲂、鳊鱼等开发的微卫星引物跨种用于三角鲂进行遗传多样性研究[5-7]，但未见有关三角鲂微卫星分子标记开发的报道。

本研究利用探针(CA)10，在三角鲂基因组PCR文库中，通过磁珠富集[8]的方法开发了15个具有多态性的微卫星分子标记，该项工作的开展将有利于三角鲂遗传多样性研究，为三角鲂的品种选育打下基础。

1 材料与方法

1.1 三角鲂基因组PCR文库构建

三角鲂取自杭州市农业科学研究院水产研究所(国家级钱塘江三角鲂原种场)，采集胸鳍后用无水乙醇保存备用。基因组DNA采用苯酚-氯仿提取法提取[9]，提取后的基因组DNA用限制性内切酶RsaⅠ 37 ℃消化2 h，利用T4-DNA连接酶将接头21-mer和25-mer[10]与酶切后的DNA片段在25 ℃条件下连接4 h，连接所用接头由上海桑尼生物科技有限公司合成。用连有接头的DNA片段作为模板，接头21-mer作为引物，进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。

1.2 筛选富集三角鲂微卫星文库

将三角鲂基因组PCR文库10 μL、10 μmol·L-1生物素标记的(CA)10探针1 μL、20×SSC 19.5 μL和双蒸水34.5 μL混合均匀。98 ℃下变性5 min后，55 ℃下杂交20 min。将杂交完毕的杂交液加入已平衡好的磁珠(每100 μL磁珠，分别用1 mL 1×TE和1 mL 6×SSC洗涤2次，每次5 min，最后用35 μL 6×SSC洗涤后保存备用)，25 ℃温育30 min，并轻轻摇动，使生物素和链霉亲和素结合。温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液。依次用洗液Ⅰ(2×SSC，0.1%SDS)、洗液Ⅱ(1×SSC)洗涤磁珠，去除不含微卫星的序列，30 μL双蒸水洗脱后室温静置10 min，释放出含有微卫星序列的单链DNA。用所获得的单链DNA作为模板，以21-mer作为引物进行PCR扩增。PCR程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。将PCR产物同T-载体(pGEM-T vector，购于Promega公司)连接，用大肠埃希菌DH5a感受态细胞进行转化，得到三角鲂微卫星文库，经过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行测序分析。

1.3 三角鲂微卫星的分析

以阳性克隆测序获得的序列作为参考序列，使用SSR筛选软件MISA进行SSR筛选。筛选标准为1个碱基重复10次及10次以上，2个碱基重复6次及6次以上，3～6个碱基重复5次及5次以上，2个微卫星之间的距离小于100 bp的时候，2个微卫星组成1个复合微卫星。用SSR出现频率和SSR平均分布距离来描述SSR，出现频率前2位的重复单元定义为优势重复单元。计算公式分别为：SSR出现频率=搜索到的SSR数量/EST序列数量；SSR平均分布频率=EST序列总碱基数/搜索到的SSR数量。

1.4 三角鲂微卫星的筛选

获得的阳性克隆在上海桑尼生物科技有限公司进行测序。利用Primer 3 interface modules对获得的阳性克隆序列进行预处理后，利用Primer 3进行SSR引物的批量设计，引物设计的参数是Tm为60 ℃，引物长度为20 bp，所有成功设计的引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。将三角鲂的基因组DNA样品作为模板，对成功设计的引物进行TouchDown PCR扩增来初步筛选能扩增的引物。采用Hotstart PCR Master Mix试剂盒(购自上海近岸科技有限公司)进行TouchDown PCR扩增。扩增条件如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 20 s，起始退火温度65 ℃，每个循环降低1 ℃，共10个循环；94 ℃30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃20 s，共20个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.5 三角鲂微卫星的分型

微卫星引物为已初步筛选能扩增的引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成，上游引物5’端加上FAM荧光标记(表1)。利用AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix试剂盒(购自Applied Biosystems公司)进行TouchDown PCR扩增。扩增条件如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 20 s，起始退火温度65 ℃，每个循环降低11 ℃，共10个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 20 s，共20个循环；72 ℃延伸30 min，4 ℃保温，-20 ℃保存备用。PCR扩增产物送上海桑尼生物科技有限公司，通过ABI Prism3730 xl测序仪进行毛细管电泳。以LIZ-500为分子量内标，通过GeneMaker ver. 2.2软件读取微卫星扩增产物的分子量数据。

1.6 数据处理

利用Cervus ver. 3.0.7[11]分析三角鲂微卫星的等位基因数、观测杂合度、期望杂合度，多态信息含量及进行Hardy-Weinberg平衡检验。其中，Hardy-Weinberg平衡检验采用Yates修正的方差检验[12]，同时采用Bonferroni修正进行显著性判别[13]。利用Micro-Checker ver. 2.2.3[14]进行空等位基因的判别并计算空等位基因频率。

2 结果与分析

本研究中，随机筛选阳性克隆600个，测序得到阳性克隆367个，其中255个克隆含有微卫星序列。255个微卫星序列中，含有微卫星座位355个，其中以AC/GT为单位的重复序列327个，占微卫星座位的92.1%，重复次数在20次以上的微卫星146个，占总数的41.1%，10～20次的202个，占总数的56.9%。

在255个微卫星序列中，除了一些微卫星序列因本身结构或两端太短不能设计引物外，其他微卫星利用引物设计软件Primer Premier 3.0设计引物15对，均为有效引物，具有多态性(表1)。

15个具有多态性的微卫星分子标记具体信息见表2。等位基因数量范围为3～16，观察杂合度为0.000 0～0.818 2，期望杂合度为0.081 8～0.922 6，多态信息含量为0.078 9～0.899 9。其中，具有高度多态性(PIC>0.5)的有6个标记，4个标记具有中度多态性(0.25

表2 三角鲂微卫星多态性位点特征分析

注：Hardy-Weinberg平衡概率值小于经Bonferroni修正的P值(P<0.003 6)则判定偏离平衡，计算时最小期望频率值取2，ND表示频率值偏小而未进行Hardy-Weinberg检验。

3 讨论

本研究中有Mt257、Mt284、Mt301、Mt309、Mt355微卫星位点未能进行Hardy-Weinberg平衡检验，这可能是由于该位点杂合度过低。Mt153位点未能进行Hardy-Weinberg平衡检验的原因可能是由于空等位基因频率过高。此外，3个微卫星位点偏离了Hardy-Weinberg平衡，这种情况的发生可能是由于研究中样本数量过少，该位点上存在基因流动，即Wahlund效应[16]。

利用Micro-Checker 软件分析表明，样品中存在空等位基因位点。低频率空等位基因常常在许多动物的微卫星研究中发现[17-18]，频率低于0.2是合理范围[19]。本研究中，有Mt19、Mt153、Mt246、Mt317、Mt355微卫星位点空等位基因频率高于0.2，可能是由于stutter峰存在或者等位基因丢失而造成的。

本研究报道了利用磁珠富集法开发的15个具有多态性的微卫星分子标记，这些新分离的分子标记将有助于三角鲂种群遗传变异、遗传结构、种群资源保护及其他方面的研究。