miR-149对急性心肌梗死的调控作用研究

张 睿 刘宏扬 尹 鹏

心肌梗死(MI)是临床上常见的一种心血管系统疾病，具有全球性、发病率高和死亡率高等特点，是指冠状动脉出现急性堵塞，导致部分心肌缺血，从而引起缺血性坏死的疾病。患者一般表现为严重心绞痛，常有胸部疼痛不适、烦躁、呼吸困难、头晕、心跳加快或不规则、恶心、呕吐等症状，并且含服硝酸甘油不可缓解。据统计，约一半的急性心肌梗死患者会出现严重的并发症，从而导致患者死亡[1，2]。研究显示，人体内约有半数以上的基因受miRNA的直接或间接调控，miRNA的异常表达和很多疾病的发生及发展都有着密切联系。现阶段，miRNA已广泛应用于心血管疾病领域，如细胞的分化、增殖、生长，以及凋亡等多个生理环节，对心血管疾病的各种生理、病理发生发展过程都有着很大影响，例如急性心肌梗死、心肌细胞纤维化和心肌肥大等[3～5]。本研究选取C57BL/6J雄性小鼠100只作为研究对象，从而探讨miR-149在心肌梗死疾病过程中的调控作用和分子机制。

1.资料与方法

1.1 临床资料 选取100只C57BL/6J雄性小鼠作为研究对象，并将其以随机数字表法均分为5组：假手术组(Sham组)、心肌梗死组(MI组)、心肌梗死+阴性对照组(MI+NC组)、心肌梗死+过表达miR-149组(MI+过表达miR-149组)以及心肌梗死+敲减miR-149组(MI+敲减miR-149组)，每组有小鼠20只，小鼠均为8周龄，体重为18～20g。

1.2 方法

1.2.1 研究miR-149在心肌梗死小鼠中的表达：假手术组(Sham组)和心肌梗死组(MI组)小鼠造模后饲养4周，收集小鼠心尖的心肌组织，采用动物组织总RNA提取试剂盒提取心肌细胞总RNA[6，7]；收集小鼠血清，采用血清总RNA提取试剂盒提取小鼠血清总RNA。采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。应用实时定量聚合酶链式反应检测目的基因(miR-149)的相对表达水平，以研究miR-149在心肌梗死小鼠心肌组织和血清中的表达。

1.2.2 研究miR-149对心肌梗死的调控作用：小鼠造模后饲养4周，采用超声心动图检测各组小鼠左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室短轴短缩率(LVFS)和左室射血分数(LVEF)；应用Masson染色和HE染色观察心肌组织形态和病理学改变；应用LDH试剂盒检测各组血清中LDH的含量；应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清样本中肌钙蛋白T(cTnT)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平，以研究miR-149对心肌梗死的调控作用。

1.2.3 研究miR-149对心肌细胞凋亡的调控作用：小鼠造模后饲养4周，应用TUNEL染色检测小鼠心肌细胞凋亡情况；应用实时定量聚合酶链式反应和western blot实验检测凋亡相关蛋白Bax、Bak、caspase-3、Bcl-2的表达情况，以研究miR-149对心肌细胞凋亡的调控作用。

1.2.4 研究miR-149调控心肌梗死的分子机制：小鼠造模后饲养4周，应用western blot实验检测AMPK、Wnt通路、Notch通路等相关蛋白的表达情况，以研究miR-149调控心肌梗死的分子机制。

1.3 评价指标 按照上述研究方法，统计并比较5组小鼠相关指标的表达情况，从而探讨miR-149在心肌梗死小鼠中的调控作用及其分子机制[8，9]。

2.结果

2.1 小鼠miR-149表达量的比较 通过上述方法，与Sham组相比，MI组和MI+NC组的miR-149的表达量均升高；MI+敲减miR-149组小鼠miR-149的表达量低于MI组和 MI+NC组，差异明显且具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 小鼠miR-149表达量的比较

2.2 小鼠体内促凋亡相关基因蛋白表达的比较 通过上述方法，与Sham组相比，MI组和MI+NC组的Bak表达量上升，而Bcl-2、PI3K、p-ATK等的蛋白表达量下降(P<0.01)；MI+敲减miR-149组小鼠的Bax蛋白表达量相较于MI组和MI+NC组下降，而Bcl-2、PI3K、p-ATK等上升，差异均具有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 小鼠体内促凋亡相关基因蛋白表达的比较

3.讨论

心肌梗死是一种常见的冠状动脉疾病，近些年来我国急性心肌梗死的患病率和死亡率在逐年上升，已经成为危害人们生命健康的重大疾病之一。现阶段，临床上主要根据患者的临床症状、心电图以及心肌标志物(如Mb、cTnI、CK-MB)等进行诊断，但心肌标志物的检测目前还存在局限性，因此寻找新的急性心肌梗死生物诊断标志物具有重要意义。microRNA是一类广泛存在于真核生物中内源性表达的小分子非编码单链RNA，在转录后可负向调节基因的表达水平，从而对疾病有一定的调控作用。据报道，在急性心肌梗死的进展过程中，患者均存在miRNA的异常表达谱，临床上可将特异性表达的miRNA作为急性心肌梗死早期诊断的分子标记物。此外，miRNA还可影响心肌细胞的生物学功能，进而对急性心肌梗死的发生及发展过程造成影响。

在本研究中，与Sham组比较，MI组和MI+NC组小鼠的miR-149的表达量均有所升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，而MI+敲减miR-149组小鼠的miR-149的表达量小于MI组和MI+NC组，差异有统计学意义(P<0.01)；与Sham组比较，MI组和MI+NC组小鼠的Bax蛋白表达量有所上升(P<0.01)，而Bcl-2、PI3K和p-AKT蛋白表达量下降(P<0.01)；与MI组和MI+NC组相比较，MI+敲减miR-149组小鼠的Bax蛋白表达量下降(P<0.01)，Bcl-2、PI3K、p-AKT蛋白表达量上升(P<0.01)；因此，我们可认为miR-149在心肌梗死小鼠的心肌组织中表达较高，降低其表达可抑制细胞凋亡，从而抑制心肌梗死的发生和发展。