肿瘤患者卵巢储备功能受损机制及保护并促进生育力的研究进展

2020-12-05星综述苏亦平审校

东南国防医药 2020年1期

李星综述，苏亦平审校

0 引言

2018年全球新增癌症患者1810万例，其中女性癌症患者860 万例，发病率亚洲占47.5%，死亡率超50%，15 至44 岁女性患者超过127 万，而乳腺癌发病率最高24.2%，宫颈癌发病率6.6%，卵巢癌发病率3.4%［1］。在过去的二十年里，癌症治疗技术的进步使年轻癌症患者的存活率显著提高。然而，目前的癌症治疗技术，尤其是化疗和盆腔放疗，对生殖功能有不利影响。Selter 等［2］对美国2009-2016年间接受手术和化疗的18 781例女性癌症患者进行了是否接受生育保存及咨询服务的统计，结果显示31.7%的人接受了保留生育能力的测评，保育率从2009年的1.0%上升到2016年的5.5%。可见虽然目前接受保育措施的人较少，但在逐年增加，表明生殖服务正开始成为育龄妇女肿瘤治疗的一个更重要的方面。美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）建议肿瘤专家在诊断后不久即需要与年轻女性患者讨论治疗后不孕的风险与保留生育功能的选择方法［3］。年轻癌症患者的卵巢功能受损可导致为卵巢早衰，引起绝经期症状，如潮热出汗、情绪不稳、泌尿生殖器萎缩、失眠、阴道干涩、骨质疏松等。卵巢储备功能受损导致生殖功能下降和不孕，使患者身心健康受损发生家庭社会矛盾冲突。因此，肿瘤患者生育能力的保护及恢复一直受到业界广泛关注，全世界正在努力建立肿瘤患者的生育力保护方案。

1 化疗药物对卵巢功能的损伤机制

卵巢储备功能是指卵巢原始卵泡被激活后生长、发育、产生成熟的可受精卵母细胞的能力，代表女性生育水平。临床上常用卵泡刺激素、雌二醇、抗苗勒管激素、卵巢体积及窦卵泡计数等来评估卵巢储备功能。放化疗是造成肿瘤患者卵巢储备功能受损的最主要原因，而化疗药物引起卵巢损伤的相关机制至今尚未被充分揭示。细胞毒性化疗药物按作用方式主要分为七大类：烷化剂、铂类衍生物、蒽环类抗生素、植物生物碱、抗代谢物、紫杉烷类和生物制剂。烷化剂的活性代谢产物与DNA 交联，抑制DNA 的合成和功能。铂衍生物共价结合DNA形成链内和链间交联，导致DNA在复制过程中断裂。蒽环类抗生素干扰DNA 转录，抑制拓扑异构酶Ⅱ及产生氧自由基导致DNA 断裂。抗代谢物直接抑制DNA、RNA 的合成。生物碱和紫杉烷类在有丝分裂中抑制微管蛋白聚合并破坏微管蛋白组装，干扰细胞有丝分裂。最终结果表现为原始卵泡被诱导激活、成熟卵母细胞凋亡以及对支持细胞（卵泡膜细胞和颗粒细胞）的损伤。

2 保护策略

2.1 药物促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）较自然的GnRH 分子拥有更高的受体亲和力和更低的酶降解能力，从而竞争性抑制GnRH 的生物活性。多项临床试验和荟萃分析表明，绝经前期妇女在接受化疗期间使用GnRH-a 进行卵巢功能抑制，与未接受化疗的患者相比，发生卵巢衰竭的可能性更小，月经恢复的几率也更高［4-5］。然而，多项其他研究未能证实这些发现，如2011年的一项前瞻性随机试验中将60例年龄<46岁且激素不敏感乳腺癌患者随机分配为接受蒽环类/环磷酰胺（有或无紫杉烷）新辅助化疗，有或无戈舍瑞林组。结果显示与仅接受化疗的患者比较，接受戈舍瑞林同时接受现代新辅助化疗的绝经前乳腺癌患者在化疗结束后6个月闭经率并未明显下降［6］。GnRH-a 理论上可能影响化疗对雌激素敏感性肿瘤的疗效，然而，这种对化疗的负面影响尚未得到证实。化疗期间使用卵巢抑制来保护卵巢功能的原理也尚不清楚，化疗前应用GnRH对于卵巢功能的保护效果至今仍有争议。因此，ASCO 最新更新的指南建议，GnRH 激动剂只在无法应用已证实具有生育能力保护的方法的年轻乳腺癌患者中使用［7］。

免疫调节剂AS101 抑制PI3K/PTEN/Akt 信号通路，雷帕霉素抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路［8］，均可减少原始卵泡的活化，从而降低环磷酰胺对卵巢储备功能的损害［9］。神经酰胺-1-磷酸抑制卵泡发育和凋亡减少环磷酰胺诱导的卵巢损伤［10］。抑制糖原合成酶激酶-3 调节氧化应激减少多柔比星诱导的促性腺毒性［11］。褪黑激素抑制PTEN/AKT/FOXO3a信号通路中的磷酸化反应减少顺铂诱导的卵泡丢失［12］。鞘氨醇-1-磷酸通过鞘磷脂途径抑制细胞凋亡减少卵泡丢失［13］。这些抑制活化和凋亡的药物是否会对化疗效果造成干扰，以及这些幸存下来的卵泡携带的基因是否正常有待进一步研究。

此外，有研究表明褪黑素能减少射线对大鼠卵巢功能的损伤，其机制可能与褪黑素抑制射线诱导的Caspase3激活有关［14］。

2.2 干细胞移植干细胞一直是一个研究热点，包括胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是一种存在于已分化组织中的未分化细胞，广泛存在于脑、骨髓、外周血、皮肤、肝及生殖腺等。其中原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）、卵原干细胞（oogonial stem cells，OSCs）、微小胚胎样干细胞（very small embryonic-like stem cells，VSELs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPSCs）在卵巢功能和生殖能力方面的研究较有代表性。

PGCs在发育过程中随性腺嵴迁移，被认为也迁移到所有发育器官，并在各成年器官中存活，作为组织干细胞的后备池。诸多研究表明提供合适的生长因子混合物时，体外分离的雌性和雄性性腺PGCs均能进入第一次减数分裂前期，将减数分裂前期的雌性PGCs 与卵巢体细胞聚集重建卵巢，移植到同基因宿主的肾包膜或卵巢皮质中，能够形成前腔和前腔滤泡，发育成减数分裂能力强甚至可受精的卵母细胞［15］。受孕后2个月人PGCs 分化为卵母细胞，受孕后6个月开始形成原始卵泡，因此成人卵巢中无PGCs。目前，从胚胎或脐带中提取含有PGCs 的组织进行体内移植，或将PGCs 体外培育后移植回青春期前患者的性腺中，是比较有希望产生成熟卵子的方法［16］。胚胎干细胞的分离提取需要破坏人类胚胎，因而受到伦理限制。脐带间充质干细胞（human umbilical cordmesenchymal stem cells，HuMSCs）因其来源于分娩后的脐带而避免了这一局限，并且具有原材料数量多，洁净度高，体外易分离培养，免疫原性低，利于异体移植，高分化潜能等优点。因此，HuMSCs 在临床上具有更广泛的应用前景。

因为新生儿卵巢中估计的卵母细胞数量远多于成人排卵卵母细胞和闭锁卵泡的数量之和，有人猜测卵巢中存在增殖性生殖细胞，在过去的二十年中，OSCs在成人卵巢中的存在一直是一个有争议的话题。越来越多的研究发现了在小鼠、大鼠、牛、和成人的卵巢中OSCs 的存在［17］，但诱导分化OSCs 的机制尚不明确，也无证据表明生理条件下OSCs对原始卵泡池有贡献。

因为分子量小，长期处于静止状态，不易被观察者发现等原因，VSELs 自提出后其存在至今仍有争议。VSELs 被认为是最原始的干细胞，普遍存在于成人所有器官中，因其在表观遗传学和发育上更成熟，VSELs易分化为三个胚层，并在体外自发产生精子和卵母细胞。在培养中不易分裂，也不会产生畸胎瘤或在发育中的胚胎内整合。这种相对静止的特性使其能够在各种毒性损伤中存活。肿瘤治疗后存活的VSELs 可靶向诱导非功能性性腺的内源性再生，并且无相关的伦理或免疫排斥问题［18］。

IPSCs 是一类由Oct3/4，Sox2、c-Myc 和Klf4 这四种转录因子基因诱导体细胞发生转化产生的，其在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、畸胎瘤生成能力及分化能力等方面都与胚胎干细胞相似，但无伦理及免疫排斥问题。因易诱发线粒体基因突变而致癌等基因问题饱受争议，其在再生医学及生殖医学领域仍有发展潜能［19］。

2.3 手术对于一些良性肿瘤患者，尤其是卵巢肿瘤，手术对卵巢功能的影响是最主要的，囊肿剥除术中直接丢失了部分正常卵泡及支持细胞，手术中热损伤、血供减少、术后炎症反应以及腹腔镜手术中的CO2高暴露［20］等均会造成卵巢储备功能受损。但有文章表明全子宫切除术及双侧输卵管切除术并不会造成卵巢功能下降［21］。育龄期盆腔恶性肿瘤患者在接受盆腔照射前进行卵巢移位术是目前临床上常用的减少放疗对生育功能损害的手段［22］。常移位于圆韧带基底部、结肠旁沟外侧及肾下极水平，成功率与患者年龄、血管蒂长度位置、放疗范围时间等有关，术后严重并发症是血供受损及输卵管梗死。术后有可能出现卵巢囊肿，这是卵巢功能受损的标志［23］。然而，在大多数情况下，这些囊肿是不需要治疗的。大量回顾性研究比较了腹腔镜下卵巢囊肿剥除术中的三种常用止血方法：双极电凝，超声刀及缝扎止血在卵巢储备功能方面的影响，发现缝扎止血影响较小，超声刀或双极电凝止血术影响较大，应谨慎使用止血电凝［24-25］。CO2激光消融法与传统腹腔镜卵巢囊肿剥除术相比对卵巢周围组织损伤最小［26］，但消融法具有较高的复发率，相关临床研究较少。此外，腹腔镜下卵巢囊肿剥除术中应用垂体后叶素能缩短手术时间，减少术中出血量，有利于保护卵巢功能［27］。

2.4 卵巢组织冻存胚胎冻存是临床发展较成熟的一种有效保育手段，广泛应用于体外受精治疗［28］，可提供给已婚女性及愿意接受供精的育龄女性。在一项临床研究中有33例乳腺癌患者接受了胚胎冻存并移植，平均移植时间5.25年，移植存活率45%［29］。有研究显示移植前应用阿托西班可提高冻存胚胎移植的成功率［30］，应用GnRH 拮抗剂或激动剂可提高卵母细胞数量与累计活产率［31］。成熟卵母细胞冻存是应用更为广泛的一种保育手段，可提供给未婚育龄女性及拒绝行胚胎冻存的患者。近年来，玻璃化冷冻方法通过使用高初始浓度的冷冻保护剂和超快速冷却以尽量减少结晶，逐渐替代了慢冷冻方法，与慢冷冻技术相比，玻璃化冷冻技术使解冻后的卵母细胞存活率和妊娠率更高［32］。多项回顾性队列研究发现玻璃化冷冻的卵母细胞与新鲜卵母细胞在植入成功率、持续妊娠率及活产率方面无明显差异［33-34］，且与贮藏时间无关（5年以下）［35］，主要取决于患者年龄及卵子质量［36］。胚胎冻存和成熟卵母细胞冻存都需要卵巢刺激后再进行卵子质量检测，而控制卵巢过度刺激的恢复过程约需2～3周，对于有些癌症来说可能会耽误病情。因此临床医师需要在排除卵巢组织有无癌症细胞转移的情况下，根据患者的年龄、卵巢储备、卵泡刺激素水平、抗苗勒氏管激素水平等选择合适的刺激方案和促性腺激素剂量。

卵巢组织冻存是通过手术获得卵巢皮质组织冻存，然后将解冻后组织移植回盆腔（原位或异位）的一种保育手段，为青春期前需接受癌症放化疗患者提供了途径。爱丁堡标准（Edinburgh criteria）建议卵巢组织冻存的患者年龄不超过35岁，若患者卵巢储备功能良好，不超过38岁。原位移植是恢复生育功能及内分泌功能的首选方法［37］，移植部位大多在盆腔腹膜上，卵巢内部或者卵巢表面。待移植卵巢组织一般占整个卵巢组织的15%～25%。Demeestere等［38］在2015年报告了第1例青春期前接受化疗患者卵巢组织冻存移植后的活产。关于卵巢组织移植的时间限制，国际上无统一指南，一般建议结束放化疗治疗3个月以上，并且无放化疗合并症（如腹水，恶病质等）。卵巢功能恢复多在移植后3.5～6.5个月。内分泌恢复率甚至高于排卵功能恢复率［39］，一般高于60%［40］，约2/3的卵巢组织在移植1年后仍有功能［40］。然而，进一步研究发现卵巢组织移植有造成肿瘤复发转移及移植组织恶变的风险，尤其是血液系统肿瘤及卵巢癌等［41］。移植妊娠成功后立即再次取出冻存可降低复发风险［42］。卵母细胞体外成熟也可降低肿瘤复发风险，并且未成熟卵母细胞不需要通过卵巢刺激就可获得，从而避免卵巢过度刺激综合征等并发症的出现，可与卵巢组织联合冻存。相关活产报道较少，成熟率较低［43］。这一技术目前仍处于实验阶段，经济效益与安全性尚未得到证实。人工卵巢提供了规避癌症复发风险的另一解决方案。人工卵巢即从卵巢组织中分离卵泡及基质细胞，将之移植到人工纤维支架中，一项测试最适纤维蛋白基质浓度的实验发现，F50/T50 组合在超微结构和刚性方面最类似于人卵巢皮质［44］，迄今为止仍处于动物实验阶段［45］。