基于整合素介导的炎症通路分析PM2.5对人血管内皮细胞的损伤机制

张林 余路阳 暴一众*

近年来实验研究表明，PM2.5可能推动血管内皮细胞炎症反应的发生从而损伤内皮细胞进一步引发各类心血管疾病［1］，但其引发的损伤程度、特别是损伤机制和通路并未明确。在炎症反应的发展过程中，JNK、p38、IKK等蛋白激酶起关键作用，其可以活化多种核转录因子（AP-1、NF-κB）等，使其入核调控大量炎症因子产生，引发炎症反应［2］。临床研究发现，人体血浆内的vWF含量与空气中PM2.5浓度呈正比［3］。而vWF是细胞外基质（ECM）成员之一，能与整合素（ITG）特异性结合，激发ITG介导的信号通路［4］。2017年6月至2019年3月作者通过实验研究，探讨ITG介导通路在PM2.5诱导JNK、p38、IKK等蛋白激酶表达、引发炎症反应、损伤血管内皮细胞中的作用，分析PM2.5损伤血管内皮细胞、引发心血管疾病的分子机制。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂中流量颗粒物采样器（崂应2050，青岛崂山应用技术研究所）、BX53型倒置显微镜（日本OLYMPUS）；CytoFlex分析型流式细胞仪（美国Beckman）；ThermoForma3111型CO2培 养 箱（美 国Thermo）；垂直板电泳仪；半干转膜仪（美国Bio-Rad）；多功能酶标仪（上海申顺生物）。HUVEC细胞（CRL1730，美国ATCC）；乙醇（中国华源医疗）；胎牛血清（杭州四季青生物）；DMEM高糖培养液（杭州吉诺生物）；BCA蛋白浓度检测试剂盒、噻唑蓝（MTT）（上海碧云天）；MDA、SOD、LDH检测试剂盒（南京建成生物）；ROSELISA试剂盒（青岛捷世康生物）；vWFELISA试剂盒（上海乔羽生物）；各类蛋白抗体（英国Abcam）；磷酸缓冲盐溶液（PBS）（天津灏洋生物）。

1.2 HUVEC培养将HUVEC接种到含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，放入培养箱中培养。当细胞长满培养瓶，使用胰酶-EDTA消化液对细胞传代。细胞量达到所需要时，用血细胞计数板放在倒置显微镜下进行细胞计数，调整细胞浓度，注入细胞板中培养，备用。

1.3 PM2.5采集及染毒液制备在浙江中医药大学实验楼6楼户外平台设置采样点放置PM2.5采样器（采样流量100L/min）。单次采样为24h，连续采样。将采样器内收集PM2.5的滤膜取出，剪成小块浸入去离子水中，放入超声振荡器中振荡4次，温度20℃，30min/次，振荡后用6层无菌纱布过滤收集滤液，将滤液用真空冷冻干燥机冷冻干燥制成干粉。称取干粉50mg加入1mlPBS溶液配制成50mg/ml的染毒母液，-80℃避光保存备用。染毒前将母液超声振荡后加入9mlPBS，稀释成5mg/ml染毒液，共10ml。取染毒液20、80、160μl，分别加入1980、1920、1840μl细胞培养液，配制成质量浓度分别为50、200、400μg/ml的PM2.5混悬培养液备用。

1.4 实验分组将培养24h的HUVEC分成2组：（1）对照组（PM2.5浓度0μg/ml）：继续用完全培养液培养；（2）染毒组（设置3个浓度梯度）：分别用不同浓度（50、200、400μg/ml）的PM2.5混悬培养液染毒培养。培养24h后，进行后续实验。

1.5 MTT法、流式细胞术法分别检测细胞存活率、凋亡率每个细胞培养孔加入MTT溶液（5g/L）20μl，于37℃、5%CO2和100%饱和湿度的培养箱中孵育4h。吸去孔内培养液，每孔加入150μlDMSO，置摇床上低速振荡10min，用酶标仪在570nm处检测每孔OD值，并计算细胞存活率。收集细胞并以1000r/min离心10min，去培养液，PBS洗涤。用500μl的Bindingbuffer重悬细胞，加入5μl的AnnexinV-FITC和5μl的PI，混匀后室温下避光反应10min，随即用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 检测细胞内MDA、SOD、LDH、ROS含量，胞外vWF含量收集各组细胞，用硫代巴比妥法检测MDA含量、黄嘌呤氧化酶法检测SOD含量（活力）、比色法检测LDH含量（活力）、ELISA法检测ROS与vWF含量。具体操作步骤按各试剂盒说明书进行。

1.7 WesternBlot法检测ITG通路中关键蛋白含量收集细胞，提取总蛋白后用BCA法检测所提取蛋白浓度，并计算电泳上样量与缓冲液体积，确保每个泳道蛋白含量达到40μg。用SDS-PAGE电泳分离蛋白质，350mA恒流1h后转到PVDF膜上。转膜后、用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1h，TBST洗涤2次。加一抗稀释液于4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加二抗处理后用TBST洗膜4次。以化学发光法检测，并采用QuantityOne软件分析条带灰度值。以β-actin、GAPDH做内参蛋白。

1.8 免疫荧光定位AP-1c-Jun蛋白亚基和NF-κBp65蛋白亚基收集细胞，用胰酶-EDTA消化液消化后，PBS清洗，多聚甲醛固定10min。结合后用PBS洗涤3次，0.2%TritonX-100通透20min，加入5%山羊血清在室温下封闭20min，加入一抗，4℃过夜，洗去一抗后，加FITC标记的二抗，孵育45min。在实验结束时，将DAPI（1mM）加入到培养基中并在37℃孵育30min，双蒸水清洗5min，吸干，中性树胶封片，荧光显微镜分析。

1.9 统计学方法采用SPSS19.0统计学软件进行分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用（LSD）检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度PM2.5作用下HUVEC存活率、凋亡率及SOD、MDA、LDH、ROS、vWF含量比较随着PM2.5浓度增加，HUVEC凋亡率呈上升趋势；细胞存活率和SOD含量呈下降趋势，MDA、LDH、ROS、vWF含量呈上升趋势。各个指标在PM2.5浓度增加到200μg/ml后，与对照组（PM2.5浓度0μg/ml）比较差异有统计学意义。见表1、图1。

2.2 PM2.5作用下ITG介导通路中各关键蛋白表达情况和核转录因子AP-1、NF-κB蛋白表达情况随着PM2.5浓度升高，ITG介导的两条通路中的关键蛋白表达量及核转录因子AP-1、NF-κB表达均上调；且在PM2.5浓度>200μg/ml，与对照组比较，上述蛋白表达量均显著上升差异有统计学意义。见图2。

2.3 PM2.5作用下核转录因子（AP-1、NF-κB）的核定位水平随着PM2.5浓度增加，AP-1c-Jun和NFκBp65荧光强度值增大，质核荧光比例下降，显示AP-1和NF-κB含量增加且进入细胞核数量上升。在PM2.5浓度达200μg/ml，与对照组比较差异有统计学意义。见图3。

表1 不同浓度PM2.5作用下HUVEC存活率、凋亡率及SOD、MDA、LDH、ROS、vWF含量比较（±s）

表1 不同浓度PM2.5作用下HUVEC存活率、凋亡率及SOD、MDA、LDH、ROS、vWF含量比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.01

PM2.5浓度（μg/ml） 细胞存活率（%） 细胞凋亡率（%） SOD（U/ml） MDA（μmol/L） LDH（U/L） ROS（mg/ml） vWF（mU/ml）0 100.00 6.43±0.95 17.92±1.06 1.31±0.3 679.7±82.23 5.77±0.11 0.592±0.027 50 92.91±2.55* 17.88±1.04* 12.71±0.94* 1.86±0.56 726.26±61.2 6.63±0.25* 0.717±0.034*200 79.18±3.15* 26.69±1.52* 7.38±0.67* 3.89±0.41* 1294.23±89.52* 9.1±0.37* 1.025±0.046*400 64.92±2.33* 40.48±1.61* 2.36±0.58* 4.28±0.49* 1340.78±93.48* 8.94±0.39* 1.207±0.057*

图1 不同浓度PM2.5作用下HUVEC的流式散点分布图

图2 不同浓度PM2.5作用下HUVEC内ITG通路关键蛋白及核转录因子表达

图3 不同浓度PM2.5作用下细胞内AP-1 c-Jun和NF-κB p65的核定位水平比较

3 讨论

ROS、MDA、LDH、SOD和vWF均为细胞损伤指标［5］，其中过量的ROS是细胞损伤的重要标志，可通过过氧化细胞膜和细胞器膜上的脂质、改变胞内蛋白活性、参与多条细胞信号通路影响核内DNA转录并进一步引发炎症反应损伤细胞；MDA为线粒体内膜上ROS与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的终产物，具有较强的细胞毒性，可通过引发炎症反应、损伤线粒体等途径损伤细胞；LDH为糖酵解酶，也是细胞重要损伤指标之一，其含量与细胞损伤程度成正比；SOD是细胞内抗氧化酶，可通过清除超氧阴离子、减轻活性氧损害保护细胞；vWF是ITG特异性结合因子，也是血管内皮损伤和功能障碍的标记物［4］。本实验结果显示，随着PM2.5浓度升高，HUVEC内ROS、MDA、LDH含量显著升高，SOD含量显著降低，胞外vWF含量显著升高，同时HUVEC存活率呈现下降趋势、凋亡率呈上升趋势，表明PM2.5可通过增加过氧化水平、抑制细胞抗氧化修复能力、增加细胞毒性、改变细胞内信号通路并影响核内DNA转录、最终激活炎症反应对HUVEC造成损伤。且当PM2.5浓度达到200μg/ml后，损伤程度显著。

ITG是细胞粘附分子家族的重要成员，是一组广泛分布于各类细胞表面的跨膜糖蛋白受体，是介导细胞与ECM之间相互作用的主要分子。其可影响和调控细胞的粘附迁移、增殖和凋亡，参与细胞的信号转导，影响胞内基因表达，进而参与较多重要的生理病理过程［6］。本实验结果显示：随着PM2.5浓度增加，胞外vWF含量显著上升。而vWF是ECM中的重要成员，能与ITG特异性结合，激发胞内ITG介导的信号通路。研究结果表明，随着vWF含量上升，通过ITG传入到血管内皮细胞内的信号被异常放大。

ITG将胞外信号传入胞内后，会促进胞质内Src家族激酶活化，进而作用并激活胞质中小G蛋白家族中的RhoA蛋白［6］。YungBS等对于心脏损伤机制的最新研究发现，在心血管系统中，RhoA被激活后，可能会与由G蛋白调控因子活化的GTP结合，刺激PLC激活［7］。PLC是Ca2+信号通路的上游因子，可开启钙离子通道，促使胞内钙离子浓度升高，并促使细胞质中的PKC结合到质膜上，在钙离子的作用下激活PKC［8］。本实验结果显示：随着PM2.5浓度增加，HUVEC内PLC、PKC蛋白表达水平显著上升。表明在PM2.5侵染下，ITG传入信号异常放大，血管内皮细胞内PLC过表达并被过度激活，这一机制在血管内皮细胞的损伤发展中起重要作用；并因此异常激活Ca2+信号通路，导致下游的PKC异常表达并激活。Chen等［9］研究发现，PKC与MKK4有密切联系，激活的PKC会使胞质内MKK4磷酸化并激活MKK4。而MKK4是MAPK通路中的蛋白，可通过苏氨酸和酪氨酸残基的双重磷酸化激活JNK和p38［10］。本实验结果显示：随着PM2.5浓度增加，HUVEC内MKK4、p38、JNK蛋白表达水平显著上升。表明PKC的异常激活传导至下游MKK4，并因此过度激活MAPK信号通路和下游核转录因子p38、JNK。本研究结果揭示：随着PM2.5浓度增加，胞外vWF含量显著上升，通过ITG传入至血管内皮细胞内的信号被异常放大，过度激活ITG介导的“ITG-Ca2+信号通路-MAPK信号通路”，导致p38和JNK被异常激活。信号传导通路示意图见图4。

图4 ITG-Ca2+信号通路-MAPK信号通路和ITG- FAK粘附通路

此外，ITG与ECM结合后，可在细胞膜上聚集成簇，导致细胞骨架重新组合形成粘着斑，磷酸化FAK的Tyr397位点，使其激活，从而激活FAK粘附通路［10］。在FAK粘附通路中，活化后的FAK可招募并活化信号分子P130cas和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。一方面，激活后的P130Cas可与接头蛋白Crk的SH2结构域结合，导致Crk的SH3结构域与“CrkSH3域结合鸟嘌呤核苷酸交换因子”（C3G）结合从而活化C3G；活化后的C3G使Rap1中的GDP变成GTP，导致Rap1构象改变使其活化；并进一步激活下游JNK。另一方面，PI3K是PI3K-AKT信号通路上游分子，可以通过激活PI3K-AKT通路最终激活下游分子AKT，进而磷酸化激活IKK［10］。本实验结果显示，随着PM2.5浓度增加，FAK粘附通路中关键蛋白FAK、Crk、Rap1、JNK、AKT、IKK表达水平均显著升高。表明PM2.5可通过增加胞外vWF含量，并通过ITG使胞内传入信号异常放大，过度激活ITG介导的“ITG-FAK粘附通路”，从而异常激活下游分子JNK和IKK。

p38、JNK、IKK等蛋白在炎症反应发生中起到重要作用，其是激活AP-1、NF-κB等核转录因子的关键激酶。其中，JNK、p38能使c-Jun和c-fos磷酸化，在胞浆中组成同源或异源二聚体复合物AP-1，使其激活并入核；IKK能使IkB（NF-kB抑制分子）结构域的Ser32/36磷酸化，加速IkB的降解，暴露出NF-kB核定位信号，激活NF-kB并使其入核；AP-1、NF-kB等核转录因子入核后，可调控炎症因子基因的转录翻译，促使炎症因子产生，激发炎症反应［2］。蛋白实验显示，随着PM2.5浓度增加，AP-1、NF-κB表达显著升高；核定位实验结果显示，PM2.5作用下，AP-1、NF-κB在细胞核内含量显著增加、细胞质中含量显著减少，显示其大量入核。表明核转录因子AP-1、NF-κB被异常激活并入核激发炎症反应。

综上所述，PM2.5可增加血管内皮细胞外vWF含量，并通过ITG将这一异常信号传入到血管内皮细胞内部，异常激活ITG介导的ITG-Ca2+信号通路-MAPK信号通路和ITG-FAK粘附通路，活化p38、JNK、IKK等激酶，激活AP-1、NF-κB等核转录因子并使其入核，进而调控各类炎症因子产生，引发炎症反应，损伤内皮细胞，诱导和引发各类心血管疾病。