羊传染性胸膜肺炎与羊口疮混合感染的诊断与分析

赵洁雅 沙吾尔江·阿不都力艾拉 郭会玲 古丽·巴哈吾拉音 汪阳 木克日木 古丽扎提 梁纪元 陈世军 夏俊 薛晶 金映红

摘    要：為探明新疆某羊场疑似羊口疮和羊胸膜肺炎感染死亡羊只的病原，本试验在无菌条件下对送检肺脏病料进行细菌培养，并用支原体引物进行PCR扩增，后利用羔羊睾丸细胞对处理后的唇部痂皮病料进行毒株分离，分离到的毒株用羊口疮特异性引物进行PCR扩增和动物回归试验。结果显示，根据细菌培养和PCR扩增判断死亡羊只的传染性胸膜肺炎阳性，用羊睾丸细胞成功分离到的毒株经PCR验证显示羊口疮阳性，通过动物回归试验羊口疮攻毒组羊只出现口唇部脓疱痂皮等羊口疮典型病变，综合说明死亡羊只为传染性胸膜肺炎和羊口疮病原混合感染。本试验成功分离到一株羊口疮毒株且该毒株有较强的致病性，为今后进一步研制羊口疮疫苗打下了良好的基础。

关键词：羊;传染性胸膜肺炎;口疮病毒;鉴定

中图分类号：S858.26          文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.12.019

Diagnosis and Analysis of Mixed Infection of Infectious Pleuropneumonia and Aphthous Sore in Sheep

ZHAO Jieya1， SHAJIANG·Abduli Ella2， GUO Huiling3， GURI·Bahawula Yin4， WANG Yang1， MUKE Rimu3， GURI Zati3， LIANG Jian1， CHEN Shijun3， XIA Jun3， XUE Jin3， JIN Yinghong3

（1.College of Animal Madicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830000，China; 2. Xinjiang Animal Health Supervision Institute， Urumqi， Xinjiang 830000， China; 3.Institute of Veterinary Science， Xinjiang Academy of Animal Science， Urumqi 830000，China; 4. Yanqi County Beidaqu Township Animal Husbandry and Veterinary Station， Yanqi， Xinjiang 841100， China）

Abstract：To find out the pathogen of dead sheep infected with sheep aphthous ulcer and pleuropneumonia in a sheep farm in Xinjiang， the bacteria culture was performed on the samples of pulmonary diseases under aseptic conditions; the PCR amplification was performed with Mycoplasma primers of sheep; the strains were isolated from the crusts of the diseased lips with the sheep testicular cells， and the PCR amplification were performed with the specific primers for sheep sores; the animal regression test were performed to judge the virulence of the sheep oral sore virus strain. According to the results of the bacterial culture and PCR amplification indicated that the sheep infected sheep infectious pleuropneumonia. The virus strain was successfully isolated with sheep testis cells， and the results of PCR showed that the sheep infected ORFV. The animal regression experiment showed that the  typical lesions of sheep's mouth sores such as lip pustular scab skin appeared in the poisonous group， indicating that the strain had strong pathogenicity. Comprehensively， the dead sheep were mixed infection of sheep infectious pleuropneumonia and sheep's mouth sore pathogen. This experiment successfully isolated a strain of sheep's mouth sore and the strain had strong pathogenicity， which laid a good foundation for further development of sheep's mouth sore vaccine in the future.

Key words： sheep; infectious pleuropneumonia; oral sore virus; identification

支原體是目前已知的缺乏细胞壁但能独立生活的最小原核微生物[1]，该病原微生物于1963年在英格兰首次由Mackey等[2]从绵羊体内分离到，后来在其他国家和地区均有出现该病的报道[3]，发病羊表现在肺脏和胸膜出现浆液性状和纤维素性状的炎症。该病发病率较高、发病速度较快且流行范围广泛，死亡率极高，给养羊业造成巨大的危害。羊口疮又称为羊传染性脓疱、羊接触传染性脓疱皮炎，是由羊口疮病毒（ORFV）引起的一种主要感染绵羊和山羊等小反刍兽的高度接触性传染病[4]。羊口疮病毒属于痘病毒科副痘病毒属，一般呈椭圆形、球形、锥形等，ORFV基因组全长约140 kb，羊口疮病毒的编码区又分为中心保守区和末端变异区，中心保守区是病毒完成复制和形成病毒粒子所必需的区域，两侧非必须的末端变异区主要为病毒的毒力基因，与病毒的致病性密切相关[5-6]。幼龄动物对该病敏感，发病率较高但致死率不高;而成年羊患羊口疮病后由于口唇部病变导致无法正常进食，影响羊只生长;此外，人在与患病动物频繁接触时也有被感染的可能[7]。羊口疮最早被发现于欧洲，现已分布于全世界[8]，其传染性强、传播速度快，据报道我国主要养羊地区如新疆、甘肃、青海、内蒙古及东北三省均有该病发生和流行[9-14]。

2019年1月，新疆某羊场部分羊只出现羊口唇部丘疹、溃疡、痂皮和呼吸道的症状，初步怀疑为羊口疮和支原体的混合感染，故以死亡羊肺组织及口唇部痂皮为材料，通过细菌培养和PCR方法对相关病症和病毒进行诊断与鉴定，旨在为新疆羊传染性胸膜肺炎和羊口疮混合感染的流行病学调查及防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 病料采集与主要试剂

病料采自新疆某羊场发病死亡羊只。T4连接酶购自NEB公司;pMD-18T载体购自宝生物工程（大连）有限公司;E. coli感受态细胞DH5a由新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）提供;克隆载体pGEM-T购自Promega公司;ExTaq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoR I、DNA胶回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒、LB培养基、BHI培养基、DNA Marker DL2000均购自宝生物工程（大连）有限公司;MEM细胞培养液、血清购自Hyclone公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 实验室诊断

1.2.1 细菌培养 在无菌条件下，取死亡羊只肺和肝组织涂片，接种于普通LB培养平板和BHI培养平板，置37 ℃培养14 h，观察是否有细菌生长。

1.2.2 支原体鉴定 参照绵羊传染性胸膜肺炎基因的保守序列，用生物软件DNAstar分别设计支原体目和绵羊支原体两种引物，扩增片段长度分别为380 bp和600 bp。PCR扩增体系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，超纯水19 μL，混合均匀后PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。反应结束后，上样1%琼脂糖凝胶电泳。琼脂凝胶回收试剂盒回收PCR产物，送上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 羊口疮鉴定 （1）病料处理。将送检的口唇部痂皮组织病料按15%（w/v）比例加入PBS（青霉素终浓度100 U·mL-1，链霉素终浓度100 μg·mL-1）进行充分研磨后，以10 000 r·min-1，离心5 min，取上清，经0.22 μm滤器过滤。

（2）分离病毒株。取研磨后的病料上清液1 mL接种于生长良好的羊睾丸细胞，37 ℃吸附1 h，吸附完成后弃上清液更换完全培养基，于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱静置培养，每天观察细胞，细胞出现病变效应（CPE），反复冻融3次，12 000 r·min-1离心10 min，将上清1 mL接种到新的细胞中，连续盲传4代，直到细胞出现明显CPE，将病毒液置-20 ℃/室温（15～25 ℃）冻融3次，以10 000 r·min-1，离心5 min，取上清，经0.22μm滤器过滤，即为分离到的毒株。

（3）PCR鉴定。按照DNA提取试剂盒说明书操作，从分离到的病毒中提取DNA。用生物软件DNAstar 设计羊口疮引物，引物序列F：5-CGAACTTCCACCTCAACCACTCC-3，R：5-CCTT

GACGATGTCGCCCTTCT-3，以提取的病毒基因组DNA为模板扩增目的片段，扩增片段长度约为510 bp，PCR扩增反应体系（50 μL）：2 ×Taq PCR Master Mix25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O水补至50 μL，混合均匀后PCR扩增。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物上样1%琼脂糖凝胶跑电泳，参照标准DL2000 DNA Marker。用琼脂凝胶回收试剂盒将PCR产物回收，送上海生工生物工程有限公司测序。

1.3 动物回归试验

将4只羔羊分为2组，分别为攻毒组和对照组。攻毒组划井字接种200 μL分离出的羊口疮毒株，对照组以相同方式和剂量接种无菌PBS。攻毒后每天观察各组羔羊的临床症状并记录，观察试验组出现丘疹和溃烂的时间、病变范围大小、预后等，连续观察7 d，来判断初步分离到的羊口疮病毒株致病力强弱。

2 结果与分析

2.1 细菌培养结果

病料于普通LB培養平板和BHI培养平板涂板培养后，平板中未未观察到菌落，说明病变不是由于细菌感染引起。

2.2 支原体鉴定结果

琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，在600 bp和380 bp处均出现明亮条带，与预期相符，说明死亡羊只感染了支原体。

2.3 羊口疮鉴定结果

2.3.1 毒株分离结果 病料经处理后接种细胞，接种16 h后细胞开始出现羊口疮病毒的病变，表现为细胞出现网格状且呈变圆固缩趋势（图2），说明分离到的毒株为羊口疮病毒。

2.3.2 羊口疮分离株PCR结果 琼脂糖凝胶电泳结果（图3）显示，在510 bp出现明亮条带，与预期相符，说明分离到的病毒株为羊口疮病毒。

2.4 动物回归试验

临床观察结果（图4）为攻毒组两只绵羊在攻毒后48 h即可观察到口唇部出现丘疹，后有脓疱破溃形成结痂，无死亡羊只，而对照组正常。

3 结论与讨论

羊口疮和羊传染性胸膜肺炎是重要的人畜共患病，传播速度快，波及范围广，严重危害养羊业的发展和人类的健康。羊口疮病不会造成很高的死亡率，但是发病期间会严重影响到羊只的生长发育，导致饲养者增加经济投入，造成较高的经济损失。疫苗免疫是预防和控制羊口疮的最有效的手段，但是近年来有羊场采用弱毒活疫苗免疫羊只后不能起到有效保护作用的报道[15-16]，可能是毒株在不同地区发生了遗传变异。患羊传染性胸膜肺炎的羊的胸膜和肺脏会出现炎症，类似纤维素性状和浆液性状，死亡率极高。近来年，羊群的饲养模式更加规模化和集约化，羊的传染性胸膜炎在羊群中流行会对养羊业的经济效益造成严重的损害。若要有效防止此病的发生，必须要让绵羊传染性胸膜肺炎的诊断方式和防治手段都得到提升，以最快的速度掌握病情，同时采取积极有效的隔离措施，避免羊只相互传染，造成更大的经济损失。

本研究于新疆某羊场对疑似传染性胸膜肺炎和羊口疮的绵羊进行病情和症状跟踪记录，对死亡羊只进行剖检、病原鉴定、实验室诊断和病原分离。根据肺部病变情况初步怀疑为巴氏杆菌或羊传染性胸膜肺炎感染。为确诊和鉴别病原微生物，本试验通过对16S RNA保守区的基因扩增，判定此次病原为绵羊肺炎支原体。该方法较细菌涂片染色后形态学观察、生化试验、动物试验等更加快速、准确，为绵羊肺炎支原体感染的诊断提供参考。同时，发病羊只具备口唇部水疱、结痂等羊口疮的典型病变，为确定并分离到病原，本研究通过处理口唇部痂皮后接种于羊睾丸细胞，以细胞培养产物为模板，扩增该分离株的保守基因片段，该病毒株在羊睾丸细胞上传第5代时出现明显的病变，PCR扩增结果出现与预期大小一致的条带，表明成功分离到一株ORFV。将羊口疮病毒株接种于羔羊口唇部，两天后羔羊唇部出现明显病变，证实此次分离出的羊口疮病毒致病力较强，为今后进一步研制羊口疮疫苗打下了良好的基础，进而为该病的防控提供保障。

综合临床症状、病理变化、实验室诊断结果确诊此次发病羊只病原为绵羊传染性胸膜肺炎和羊口疮病毒混合感染，结合试验过程和疾病的特征，建议选用高敏药物或中敏药物进行临床治疗，避免滥用抗生素导致病原微生物对大量药物产生耐药性。

参考文献：

[1]鲍兴智，严军.绵羊肺炎支原体的研究进展[J].青海畜牧兽医杂志，2009，39（6）：45-46.

[2]MACKAY J， NISBET D， FOGGIE A. Isolation of pleuropneumo

nia-like organisms（Genus Mycoplasma）from cases of sheep pulmonary adenomatosis（SPA）[J]. The veterinary record， 1963， 75（21）： 550-551.

[3]MARTRENCHAR A， BOUCHEL D， ZOYEM N.Isolation and experimental studies of Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides LC and Mycoplasma ovipneumoniae in goats in northern Cameroon[J]. Small ruminant research， 1995， 16（2）： 179-184.

[4]OEM J K， ROH I S， LEE K H， et al. Phylogenetic analysis and characterization of Korean orf virus from dairy goats： case report[J]. Virology journal， 2009， 6： 167.

[5]闫丰超，邵佳，窦永喜.羊口疮病毒分子生物学的研究进展[J].中国兽医科学，2013（1）：103-109.

[6]FLEMING S B， WISE L M， MERCER A A. Molecular genetic analysis of orf virus： a poxvirus that has adapted to skin[J]. Viruses， 2015， 7（3）： 1505-1539.

[7]KUMAR N， WADHWA A， CHAUBEY K K， et al. Isolation and phylogenetic analysis of an orf virus from sheep in Makhdoom， India[J]. Virus genes， 2014， 48（2）： 312-319.

[8]DE LA CONCHA-BERMEJILLO A， GUO J， ZHANG Z， et al. Severe persistent orf in young goats[J]. Journal of veterinary diagnostic investigation， 2003， 15（5）： 423-431.

[9]向智龙，卓建华，程振涛，等.贵州地区羊口疮病毒B2L基因克隆及原核表达载体构建[J].中国畜牧兽医，2011，38（7）：76-79.

[10]于永忠，谭强，赵文博，等.羊口疮病毒黑龙江省分离株的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2013，35（8）：678-680.

[11]GU S P， SHI X T， SHI Z Y， et al. Identificationand phylogenetic analysis of an Orf virus isolated from an outbreak in Boer goat in Shanxi province[J]. Agricultural sciences in China， 2011， 10（6）： 946-953.

[12]ZHAO K， SONG D， HE W， et al. Identification and phylogenetic analysis of an Orf virus isolated from an outbreak in sheep in the Jilin province of China[J].Veterinary microbiology， 2010， 142： 408-415.

[13]姚俊，彭海生，魯富有，等.羊口疮病毒云南流行毒株的分子鉴定[J].上海畜牧兽医通讯，2012（3）：2-5.

[14]王辉，赵晓军，易建刚，等.羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因的克隆与序列分析[J].中国动物检疫，2007，

24（6）：26-27.

[15]MCAULIFFE L， HATCHELL F M， AYLING R D， et al. Detection of mycoplasma ovipneumoniae in pasteurella-vaccinated

sheep flocks with respiratory disease in England[J]. The veterinary record， 2003， 153（22）： 687-688.

[16]BORA D P， BARMAN N N， DAS S K， et al. Identification and phylogenetic analysis of orf viruses isolated from outbreaks in goats of Assam，anortheastern state of India[J]. Virus genes， 2012， 45： 98-104.