施用生物菌肥对桃园土壤养分及微生物功能多样性的影响

于会丽，徐国益，徐变变，袁玉洁，邵 微,2，王新卫，朱更瑞，鲁振华，司 鹏

(1.中国农业科学院郑州果树研究所，河南 郑州 450009；2.河南农业大学林学院，河南 郑州 450002)

生物菌肥是由一种或多种有益微生物经发酵而成的具有高效广谱、绿色环保、安全无毒特性的生物性肥料[1-3]。除含有较高有机质外，还含具有特定功能的有益微生物，不仅活化土壤养分，改善土壤理化性质[4]和土壤微生物群落结构[5]，提高土壤肥力[6-8]，还促进作物养分吸收，提高作物产量和品质[9-10]，增强作物抗病和抗逆性[11-12]。刘德兴等[13]在甜瓜上施用生物菌肥发现，生物菌肥能够提高甜瓜单果重和改善甜瓜品质。陶爱群等[14]的研究表明，施用生物菌肥可改善玉泉冬枣的光合作用及提高果实产量和改善果实品质。

土壤微生物是土壤生态系统重要的组成部分和土壤养分循环的重要参与者[15]，在土壤有机物质分解、养分释放和能量转移中起着重要作用[16]。随着人们对生物多样性重要性认识的不断深入，广泛应用各种测定方法，如微生物醌法、脂肪酸法、TGGE、DGGE和Biolog 法等研究微生物代谢功能多样性，微生物醌法、脂肪酸法、TGGE和DGGE等技术方法无法获得有关微生物群落总体活性与代谢功能的信息[17]，Biolog 方法可克服这一缺点，被广泛用于评价土壤微生物的功能多样性[18]。司鹏等[19]通过Biolog 法研究表明，在葡萄行间种植毛叶苕子能显著增加土壤微生物群落对六类碳源的利用。陈琳等[20]采用Biolog 法研究生物有机肥对板栗土壤微生物群落代谢活性的影响，结果表明，生物有机肥处理能提高土壤中微生物的活性。赵兰凤等[21]利用 Biolog 法分析了不同施肥处理对香蕉根际土壤微生物群落功能多样性的影响，表明生物有机肥处理的根际微生物活性和土壤微生物对聚合物类和胺类的利用能力均高于对照和有机肥。然而有关生物菌肥对桃园土壤微生物功能多样性影响的相关研究较少。

本研究采用 Biolog-Eco 板技术，研究生物菌肥不同施用量对桃园土壤微生物功能多样性及有效养分的影响，明确其最佳施用量，为生物菌肥在桃生产上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地基本情况

试验区位于新疆西部中心昌吉国家农业园区老龙河大棚试验基地(44°15′36″N，87°20′53″E)。海拔470 m，日照充足，年日照时数为2 700 h，年平均气温6.8℃，年平均降水量为190 mm，夏季降水量明显多于冬季，年无霜期为175 d。

1.2 试验设计

试验于2018年9月15日进行，设置5个处理：鸡粪2 000 kg·667m-2(CK)，生物菌肥200 kg·667m-2(T1)，生物菌肥300 kg·667m-2(T2)，生物菌肥500 kg·667m-2(T3)，生物菌肥1 000 kg·667m-2(T4)。每个处理设置3个小区，小区面积25 m2(5m×5m)，共种植18棵桃树，随机区组排列，每相邻小区间隔1排桃树作为保护行。单边沟施，沟深30cm，沟宽30～40 cm，所有处理均将肥料一次性施入并与土混合均匀。

1.3 试验材料

供试生物菌肥有效活益菌≥2×108CFU·g-1，功能菌为解淀粉芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌，有机质≥50%，蛋白质≥30%，N+P2O5+K2O≥10%，特别添加抗病性有益菌和铁、锰、硼、锌等微量元素，该产品执行NY884-2012肥料标准。对照用的鸡粪有机质≥48.58%，N+P2O5+K2O≥10%。

1.4 土样采集

2019年5月13日采集土样，取样方法为梅花形布点法，每个试验小区选5个点，沿桃树树冠垂直投影面积2/3处取0～20 cm和20～40 cm土壤样品，剔除石块、植物残根等杂物后，每个小区同层土样混合。一部分土样风干过筛进行土壤理化性质测定，一部分土样贮藏于-80℃冰箱进行土壤微生物功能多样性测定。

1.5 测定方法

1.5.1 土壤理化性质测定 土壤pH值采用pH计测定，水土比为2.5∶1；有机质采用重铬酸钾氧化-外加热法，有效磷采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提法，速效钾采用NH4OAc浸提-火焰光度法，硝态氮用酚二磺酸比色法，铵态氮用2 mol·L-1KCl浸提-靛酚蓝比色法[22]。

1.5.2 土壤微生物群落测定 将相当于1 g烘干土的新鲜土壤加入到盛有99 mL 0.85%灭菌生理盐水的250 mL 三角瓶中，28℃、200 r·min-1条件下振荡培养30 min，使土样与生理盐水充分混匀，再放置在4℃冰箱内静置30 min，然后加样于Biolog-Eco板微孔板中，每孔加入150 μL。25℃下培养192 h，每24 h Biolog自动读取仪读数1次。

微生物群落功能多样性的计算[23]：

Biolog-Eco板测定平均吸光值(average well color development，AWCD)，用来表示微生物的整体代谢活性[23]：

AWCD=∑(Ci-R)/n

Shannon-Wiener指数(H′)：

H′=-∑(Pi·lnPi)

Simpson 指数(D)又称优势度指数:

D=1-∑Pi2

Pielou均匀度指数(E)：

E=H′/lnS

丰富度指数(S)指被利用的碳源的总数，为每孔中(C-R)的值大于0.25的孔个数。

1.5.3 数据处理与分析 采用Microsoft Excel 2010进行数据处理；用SPSS 17.0统计软件分别进行方差分析和主成分分析；用Canoco 4.5进行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。

2 结果与分析

2.1 施用生物菌肥对桃园土壤养分的影响

生物菌肥对桃园土壤主要理化参数的影响见表1。随生物菌肥施用量的增加，土壤pH值、有机质、硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾含量呈先增加后降低趋势。

表1 不同处理对土壤主要理化参数的影响

与CK相比，0～20 cm土层T1、T2和T3处理土壤pH值和有机质含量均增加，其中T1处理土壤pH值和有机质含量最高，分别增加3.08%和20.00%，但各处理间差异未达显著水平。除T1处理外，生物菌肥处理的硝态氮含量均显著低于CK，T2处理铵态氮含量较CK增加86.26%(P<0.05)，其他处理与CK差异不显著。生物菌肥处理的土壤有效磷和速效钾含量均高于CK，其中T3处理有效磷含量和T1处理速效钾含量最高，较CK分别提高61.29%和277.43%(P<0.05)。

20～40 cm土层，与CK相比，生物菌肥处理土壤有机质和硝态氮含量降低，土壤pH值、铵态氮和速效钾含量提高，其中，T1处理土壤pH值和速效钾含量最高，较CK分别增加5.75%和265.71%(P<0.05)，且T1处理速效钾含量与其他处理差异显著。T3处理土壤铵态氮和有效磷含量最高，较CK分别增加53.59%和109.51%(P<0.05)。

2.2 施用生物菌肥桃园土壤微生物群落功能多样性

2.2.1 土壤微生物平均吸光值变化特征 平均颜色变化率(AWCD)是表征土壤微生物群落对底物碳源利用强度的指标，AWCD值越大表明微生物密度越大，活性越高；反之微生物密度越小，活性越低[24]。由图1可知，不同施肥处理下0～20 cm和20～40 cm 土层AWCD值随培养时间的延长而升高。在24～96 h内，AWCD值迅速增加，这说明土壤微生物代谢能力增强，在培养96 h后，AWCD值增长趋于缓慢。在培养结束时，0～20 cm土层微生物活性AWCD高低依次为T2>CK>T3>T1>T4，20～40 cm土层微生物活性高低依次为T2>CK>T1>T3>T4，T2处理的AWCD值最高，说明在此条件下，生物群落代谢最快，活性最强，对碳源利用能力最高。

图1 不同施肥处理土壤微生物平均吸光值随培养时间的变化

2.2.2 不同施肥处理土壤微生物群落功能多样性指数分析 选取土样培养96 h数据进行土壤微生物代谢多样性分析，不同施肥处理对桃树土壤微生物群落功能多样性指数影响不同，如表2所示，随生物菌肥施用量的增加，土壤微生物群落功能多样性指数呈先增加后降低趋势。

表2 土壤微生物群落多样性指数

0～20 cm土层，T2处理的土壤微生物群落优势度指数、丰富度指数和多样性指数最高，较CK分别增加0.21%、5.09%和0.92%，差异不显著。T2和T3处理土壤微生物群落优势度指数和均一性指数较T1处理分别提高0.42%、23.48%和0.42%、19.57%(P<0.05)。

20～40 cm土层，土壤微生物群落优势度指数为T3>T2>T1>CK>T4，其中，T2和T3处理土壤微生物群落优势度指数较CK分别提高0.22%和0.25%(P<0.05)，除T4外，生物菌肥处理间无显著差异。T4处理的土壤微生物群落丰富度指数、均一性指数和多样性指数显著低于其他处理，且其他处理间无显著差异。结果表明，T2处理增加土壤微生物群落多样性指数，T4处理降低土壤微生物群落多样性指数。

2.2.3 不同施肥处理土壤微生物对六类碳源的利用强度 由图2可知，施生物菌肥处理与鸡粪(CK)处理土壤微生物对Biolog-Eco板中不同类碳源利用强度存在差异，随生物菌肥施用量的增加土壤微生物对Biolog-Eco板中每一类碳源的利用强度呈先增加后减少趋势。

注: PM: 聚合物; CH: 碳水化合物; PA: 酚酸类化合物; CA: 羧酸类; AA: 氨基酸类; AM: 胺类,下同。不同字母表示在P<0.05水平下各处理差异显著。Note: PM: polymer; CH: carbohydrate; PA: phenolic acid compound: CA: carboxylic acids; AA: amino acids; AM: amine. The same below. Different letters indicate the significant difference between different treatments (P<0.05).

0～20 cm土层，T2处理土壤微生物对羧酸类利用强度最高，较CK提高22.67%(P<0.05)，T4处理对聚合物和碳水化合物利用强度低于其他处理，较CK分别降低31.11%和23.91%(P<0.05)。

20～40 cm土层，与CK相比，T3处理对聚合物利用强度提高25.00%(P<0.05)，其他处理间无显著性差异。T2处理对碳水化合物利用强度较CK和T4分别提高18.06%和30.77%(P<0.05)，与T1和T3处理差异不显著。由此表明，T2处理促进土壤微生物对羧酸类和碳水化合物这两类碳源的利用，T4处理抑制土壤微生物对六类碳源的利用。

2.3 土壤微生物功能多样性与土壤养分之间的冗余分析

如图3所示，冗余分析结果表明各个碳源之间存在相关关系。PM与AM呈显著正相关性，相关系数为0.69；PA、AA、CA和AM呈极显著正相关性，相关系数分别为0.85、0.80和0.80；CH与PA、CA呈显著正相关性，相关系数分别为0.69和0.64；PA与CA、AA呈极显著正相关性，相关系数分别为0.82和0.87;有机质与AA呈显著正相关，相关系数为0.68;pH与速效钾呈极显著正相关关系，相关系数为0.85。

注: OM: 有机质; AP: 速效磷; AK: 速效钾Note: OM: organic matter; AP: available phosphorus; AK: available potassium

2.4 生物菌肥对土壤微生物多样性指数、碳源利用强度及土壤养分三因素综合影响主成分分析

通过主成分分析可知(表3)，0～20 cm和20～40 cm土层，第1主成分特征值的变量解释度分别为56.19%和56.15%，是最主要的解释变量，前3个成分特征值的变量解释度分别为93.62%和93.57%，表明这3个成分是主要分析部分。对各处理在4个成分中进行综合评价(表4)，0～40 cm土层T2得分最高，分别为2.42和1.36，说明T2处理桃园土壤微生物多样性指数、碳源利用强度及养分含量最高。

表3 指标总方差分解

表4 生物菌肥对土壤微生物多样性指数、碳源利用强度及土壤养分三因素综合影响评价

3 讨 论

3.1 生物菌肥对桃园土壤养分的影响

生物菌肥能够活化土壤养分，提高土壤养分有效性。研究结果表明，施用生物菌肥能提高桃园土壤有效磷和速效钾含量，其中生物菌肥300 kg·667m-2效果最佳。可能因为生物菌肥中多数含有解淀粉芽孢杆菌等能够活化土壤难溶性磷、钾元素，从而提高有效磷和速效钾含量[25]。柳晓磊等[26]研究表明，复合微生物菌与氨基酸水溶肥配施提高了土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量；丛山等[27]在番茄上的研究发现，微生物菌肥处理均能增加土壤速效钾和有效磷含量。本研究发现，随施肥量增加土壤有效磷含量先增加后降低，其中，施肥量在1 000 kg·667m-2时，20～40 cm土层土壤有效磷含量显著低于其他菌肥处理。王立伟等[28]在番茄上施用生物菌肥也发现，生物菌肥可增加土壤中有效磷和速效钾含量，随生物菌肥施用量的增加先增加后降低。当施入土壤中的微生物菌剂过量时破坏了土壤中微生物的种群结构，进而影响土壤中磷素的有效性，使土壤有效磷含量降低[29]。同时发现，土壤有机质含量随生物菌肥施用量的增加，总体呈现降低，这与前人研究结果相反[30]，可能是随生物菌肥施用量的增加，促进了微生物对碳水化合物和氨基酸类物质的利用，而这类物质能够产生正激发效应，加速土壤中有机质的腐解，土壤有机质含量降低[31]。另外，施用生物菌肥较对照降低了土壤硝态氮含量，与刘继培等[32]研究不一致，可能与土壤中碳含量有关，C/N影响土壤中氮含量的转化[33]，具体原因有待进一步研究。

3.2 生物菌肥对桃园土壤微生物功能多样性的影响

Biolog-Eco板技术是通过测定土壤微生物对若干种不同单一碳源利用方式来鉴定微生物群落结构组成，其代谢活性差异来表征微生物种群变化和多样性。多样性指数用来反映土壤微生物群落功能[34]。本研究发现随生物菌肥用量增加，土壤微生物活性和多样性指数呈先增加后降低趋势(如表4所示)，生物菌肥用量为300 kg·667m-2时，土壤微生物活性和群落多样性最高，随着用量增加土壤微生物活性和群落多样性降低。一方面可能是由于生物菌肥用量过大，改变了土壤微生物优势种群，促进某些微生物种群生长代谢，抑制其他微生物种群生长代谢，致使某些微生物功能群与其相关的特性消失，从而降低微生物代谢活性和微生物功能多样性[35]；另一方面可能是该生物菌肥含有丰富的解淀粉芽孢杆菌，用量过大导致其分泌的抗生素、抗菌蛋白等物质抑制了真菌和其它类细菌的生长，致使土壤微生物功能多样性减退[36]。因此，生物菌肥施用量对土壤微生物群落影响须控制在一定的范围之内，过多则造成浪费，还影响其对土壤微生物效果的发挥。

本研究也表明，土壤有机质含量与微生物对氨基酸利用强度呈显著正相关关系。主要因为氨基酸是土壤有机质的重要组成部分，增加土壤碳和氮含量[37]，为微生物创造更好生长环境，从而增强土壤微生物对氨基酸类化合物利用强度[38]，有机质为土壤微生物提供生长所需的能量和营养，土壤有机质含量与微生物群落活动关系密切[39]。同时研究发现，土壤速效钾含量随土壤pH值增加而增加，这与杨磊等[40]和林毅等[41]的研究相似，在一定范围内，pH值越高，土壤速效钾含量越高，高pH值能促使土壤速效钾的释放和转移。

4 结 论

生物菌肥能够提高新疆地区桃园土壤养分和土壤微生物对碳源利用的强度，增加土壤微生物活性和功能多样性，其中，生物菌肥300 kg·667 m-2在改善桃园土壤养分以及微生物功能多样性效果最佳。