OGF-OGFr通路与肿瘤治疗研究进展

张颖 狄婷婷 胡建功

(1承德护理职业学院，河北 承德 067000；2天津中医药大学第二附属医院病理科)

传统上，针对内源性和外源性阿片类肽及其受体的研究都集中在疼痛的介导及超量应用导致成瘾上。阿片生长因子(OGF)是一种自分泌产生的内源性阿片类肽，它能与OGF受体(OGFr)相结合，下调细胞周期蛋白依赖性抑制性激酶，抑制DNA合成，使细胞周期阻滞于G(1)/S期〔1〕。OGF-OGFr是具有很强活性的抑制性通路，作为细胞增殖的调控因子，广泛存在于动物和人的细胞和肿瘤中。OGF-OGFr通路在内环境稳定、上皮再生修复中起重要调节作用，对保持健康、疾病治疗具有重要意义。研究显示两者相互作用的效应为抑制生长发育、肿瘤形成、血管形成及免疫效应〔2〕。OGF-OGFr通路失调使细胞增殖加速，导致自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展。多种药物和小分子物质可以调节OGF-OGFr通路，包括间断或连续的使用阿片类拮抗剂纳曲酮(naltrexone)、基因修饰OGFr的表达、OGF抗体中和OGF等。OGF对于恶性肿瘤的治疗具有潜在的临床价值。为了解其应用在肿瘤治疗中的意义，现将其研究进展综述如下。

1 OGF-OGFr通路的作用机制

为研究OGF如何进入细胞，用四甲基罗丹明-5(6)异硫氰酸酯(5，6-tetramethylrhodamine)标记OGF(RhoOGF)，COS-7细胞中加入RhoOGF，其在37℃时才能被细胞摄入，4℃时则无摄入，显示了完全的温度依赖性。作用15 min后RhoOGF即可检测到，30 min内在细胞质和细胞核内都能观察到，并能在细胞内存在5 h。加入100倍浓度的OGF或拮抗剂naltrexone，能减少RhoOGF进入细胞。用10-5～10-8mol/L RhoOGF培养的细胞，DNA合成减少24%～36%，与未标记的OGF作用结果相近(DNA合成减少了26%～39%)，表明RhoOGF同样能发挥作用。施加网格蛋白(clathrin)siRNA，能减少RhoOGF的摄入，导致DNA合成下降。提示OGF是通过clathrin介导的入胞作用发挥功能。入胞作用与胞内高尔基体途径无关〔3〕。OGF进入细胞是通过clathrin介导的主动转运，且具有饱和性。

OGF需要通过与OGFr结合后进一步转移到核内发挥功能，OGF-OGFr的核浆转运依赖核定位信号。为观察OGF-OGFr复合物从细胞质到细胞核的转运过程，用OGFr全长的探针与强绿色荧光蛋白(eGFP)融合，并且用siRNA敲除了核转运蛋白(karyopherin)α1,α2,α3,α4，α6,karyopherinα1，Ran，结果，头颈部鳞癌(SCCHN)SCC-1细胞株的karyopherinβ1和Ran下调，没有OGFr-eGFP被转运到核内。溴脱氧尿苷(BrdU)标记指数在siRNA karyopherinβ1和Ran沉默组比对照组增加了44%，而karyopherinα1,α2,α3,α4和α6 siRNAs组则没有变化〔4〕。显示OGF-OGFr 通路调节细胞增殖依靠karyopherinβ1介导的核浆转运，RanGTP/RanGDP以梯度变化穿过核膜，而不是依靠karyopherinα相关的适应分子。因此，OGF-OGFr复合物才能及时准确地穿过核膜转运到核内进而发挥作用。核输入物质分层的水平提供了对于OGF-OGFr精细调节多元化的通路，就像调节细胞和组织一样。

研究显示，内源性OGFr和外源性表达的OGFr-eGFP，在leptomycinB(LMB)作用下显示明显的核内累积，提示OGFr以染色体区维持(CRM)1依赖的方式转运。一段核转运信号相关的共有的DNA序列已被确认，其中亮氨酸(leucines)L217 L220 L223和L225到丙氨酸(alanine)的突变会导致核内蓄积减少。强绿色荧光蛋白标记的出核信号(NES-eGFP)对LMB发生反应，显示该序列具有独立的核转运功能。OGFr的羧基端存在着串联重复序列，6/7的串联重复序列移除后形成三角区域(deltaTR)即显示细胞抑制活性的缺失，提示此重复序列有助于受体的定位，并可能与其功能有关〔5〕。至于OGFr核转运的详细机制尚不明确。

2 阿片类拮抗剂的作用

由于其受体阻断作用，阿片类拮抗剂，如naloxone和naltrexone，仍广泛用于可逆性的毒品和酒精的过量应用。随着OGF-OGFr通路调节细胞增殖的功能被发现，它们的作用就有了新的意义。有研究〔6〕建立了组织培养模型，用低剂量naloxone(LDN)和高剂量naltrexone(HDN)对卵巢癌细胞进行短期的和连续的受体阻断，显示受体阻断的持续时间决定着对细胞增殖的反应。每天施加LDN可阻断OGF-OGFr的作用4～6 h，上调OGF和OGFr 18～20 h。LDN间断地阻断OGFr使DNA合成受到抑制，而应用HDN造成持续性的受体阻断，则导致细胞生长加速〔6〕。这可能是由于LDN上调了OGF和OGFr的表达，刺激产生足够的OGF和OGFr发挥作用。表明OGFr受体阻断持续的时间，而不是阻断剂的剂量，决定着生物治疗的结果。

LDN上调OGF和OGFr在翻译水平而不是在转录水平。短期的受体阻断后产生生长抑制作用需要p16和(或)p21细胞周期依赖性抑制性激酶，而不影响细胞生存。同时使用LDN和OGF比单独使用一种能产生更明显的抑制作用〔6〕。

OGF-OGFr通路失调，会造成人的一系列疾病，包括糖尿病、多发性硬化及肿瘤。应用拮抗剂干扰此通路，则能取得相应的治疗效果。naltrexone造成持续的受体阻断能加速1型糖尿病全层伤口愈合及其塑形期，对于治疗糖尿病并发症如角膜缺损、皮肤创伤已取得理想的效果〔7,8〕。LDN则可用来治疗自身免疫性疾病和癌症〔9〕。

naltrexone对细胞生长的作用同样存在于胰腺癌、大肠癌及SCCHN细胞。研究〔10〕证实，应用LDN、单独或联合应用代表性的化疗药〔紫杉醇(taxol)/紫杉醇(paclitaxel)/顺铂(cisplatin)〕都能影响体内外实验中的卵巢癌细胞增殖。每两天给药1次而不是连续给药，能明显减少DNA合成和细胞增殖。而且，LDN联合taxol或cisplatin可产生叠加的抗肿瘤作用。接种卵巢癌细胞的裸鼠，在LDN的作用下，造成短暂的OGFr阻断，能以非细胞毒方式通过减少DNA合成、血管形成，而不影响细胞生存；LDN联合cisplatin而不是taxol，通过减少DNA合成、血管形成对肿瘤形成产生额外的抑制作用，并不产生体重减轻等细胞毒性〔10〕。这项临床前的数据表明OGF-OGFr通路用于肿瘤的治疗是非细胞毒性的、高效的。LDN应用能起到与OGF同样的效果。

3 OGF-OGFr与肿瘤治疗

3.1卵巢癌 研究〔11〕显示，相对于卵巢表面上皮，OGF和OGFr的表达量在卵巢囊肿分别减少29%和34%(P<0.001)，在卵巢癌中分别减少58%和48%(P<0.001)。而OGF和OGFr的表达水平在原发、转移和复发卵巢癌差异无显著性〔11〕。提示OGF、OGFr的表达水平在卵巢癌中显著减少，增强此通路的功能为卵巢癌的治疗提供了有益的生物学基础。

雌裸鼠皮下接种人卵巢癌SKOV-3细胞株，每天注射OGF(10 mg/kg)、低剂量的naltrexone(LDN，0.1 mg/kg)或等量的盐水，用药40 d后，结果显示，OGF和LDN能显著减少肿瘤负荷，包括肿瘤结节的数量和重量，其机制为抑制肿瘤细胞增殖和血管形成〔12〕。

有研究用siRNA敲除人卵巢癌SKOV-3细胞中的OGFr，OGFr蛋白表达比未转染组(WT)和转染空载体组(EV)减少73%，而肿瘤细胞量增加了33%～132%，倍增时间减少了29%～35%。施加OGF或naltrexone对于OGFr siRNA组细胞量没有变化。OGFr siRNA组DNA合成增加了136%～146%，而细胞生存状况没有变化。裸鼠体内注射OGFr沉默后的卵巢癌细胞，肿瘤中OGFr表达减少，肿瘤发生率增加，肿瘤形成潜伏期缩短，肿瘤体积增加。用OGF治疗的WT和EV组，而不是OGFr siRNA组，肿瘤形成减少，肿瘤体积和重量亦减少〔13,14〕。

研究〔10〕显示，OGF-OGFr通路发挥作用是剂量依赖的、受体介导的、可逆的、蛋白和RNA依赖的，而与凋亡和坏死途径无关。可以通过施加外源性OGF、基因修饰过表达OGFr、使用LDN治疗卵巢癌。此通路可以作为卵巢癌治疗一个的靶点，可先采取预防性的用药，嗣后施行肿瘤细胞减灭术，再与标准化疗结合，可能产生叠加的效果。总之，临床前数据支持利用OGF-OGFr通路从实验室到床旁的应用，为治疗这种难治性疾病提供了有力的依据。

3.2胰腺癌 研究〔15〕显示，胰腺癌MIA PaCa-2细胞转染OGFr cDNA后，OGFr量比转染空载体组多3倍，比未转染组多4.3倍。OGFr cDNA转染组OGFr表达比对照组增加30%，肿瘤发生率减少50%，肿瘤体积减少70%，DNA合成减少24%；同时施加外源性OGF比单独转染OGFr cDNA组肿瘤体积减少55%〔15〕。此结果支持OGF-OGFr调节胰腺细胞增殖，抑制肿瘤形成。为治疗胰腺癌提供了分子生物学及药理学的基础。

使用外源性OGF或上调OGFr的表达，通过调节OGF-OGFr通路介导胰腺癌的病程，能抑制体内、外实验中胰腺癌细胞的生长。单独或与经典的化疗药联用，如吉西他滨(gemcitabine)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)导致DNA合成及生长抑制作用增强。OGFr的分子变换证实此受体对于OGF的生长抑制活性是特异的。用OGF浸膏对进展期的不能手术的胰腺癌患者进行治疗的临床前Ⅰ、Ⅱ期实验中已得到证实〔16〕。研究提示OGF用于治疗进展期胰腺癌是安全的、无细胞毒性的、高效的。

3.3甲状腺癌 免疫组化检测显示，OGF和OGFr在非髓样甲状腺癌组织及正常滤泡的胞质、胞核均可检测到〔17〕。有研究检测了人甲状腺癌未分化(ATC)细胞株(KAT-18)、乳头状癌(PTC)细胞株(KTC-1)和滤泡癌(FTC)细胞株(WRO82-1)细胞株中OGF和OGFr的存在和定位，结果显示，OGF和OGFr在3种细胞中均存在，10-6mol/L的OGF能抑制细胞生长，细胞量减少了30%；而应用naltrexone后细胞量比对照组增加了35%。用OGF抗体中和OGF，siRNA敲除OGFr均使OGF的生长抑制作用消失〔18〕。提示OGF-OGFr在甲状腺组织及肿瘤中也发挥着细胞增殖的负调控作用，对此系统进行调节可能有助于甲状腺非髓样甲状腺癌的治疗。

3.4其他

3.4.1乳腺癌 有研究检测了三阴性乳腺癌(TNBC)MDA-MD-231、BT-20细胞及人乳腺癌SK-BR-3、MCF-7细胞中OGF-OGFr的表达及对OGF的反应。结果显示，OGFr是特异性受体，肽和受体在4种细胞株中均能检测到。OGF能抑制所有细胞株的生长，减少暴露于紫杉醇中细胞的死亡〔19〕。表明OGF-OGFr通路在乳腺癌中具有相应的功能，可作为潜在的生物治疗通路，为TNBC这一难治性疾病的治疗提供了新的思路。

3.4.2头颈部鳞癌 研究显示，接种了SCCHN SCC-1细胞后肉眼可见肿瘤的裸鼠，分别接受①OGF或LDN每周1，3，7次，②Imiquimod每周1，3次，同时检测肿瘤生长及DNA合成情况。OGF和LDN使肿瘤从可见到可测量的潜伏期延长了1.6倍。OGF和LDN、Imiquimod治疗能明显减小肿瘤的体积和重量并减少DNA合成〔20〕。OGF-OGFr通路的调节对SCCHN生长的影响代表一种新的非细胞毒性的高效的治疗方法。

3.4.3肝细胞癌 集成的蛋白质组学和转录组学研究显示，肝细胞癌中长链非编码RNA同源异型核基因(HOX)转录反义基因RNA(HOTAIR)对细胞增殖的作用至少部分是通过调节OGFr的表达〔21〕。经检测肝细胞癌SK-HEP-1、HepG2和Hep3B细胞株，存在着OGF-OGFr通路并发挥着功能。OGF在细胞增殖调节中发挥强大作用，特异性抗体中和OGF能够促进细胞增殖，用siRNA沉默OGFr，甚至在加入了外源性OGF的情况下也能促进细胞增殖。证实了OGFr对介导OGF活性的重要性。OGF-OGFr通路对细胞数量的作用与DNA合成相关，并不通过促进凋亡或坏死通路。没有发现OGF和OGFr在正常和肿瘤组织中表达存在差别〔22〕。研究对肝细胞癌生物治疗战略的制订有重要的参考意义，同时也表明，不同肿瘤组织中OGF-OGFr的表达是不同的。

3.5联合化疗 肿瘤细胞的休眠是化疗中的重要问题。由于它限制了只能以细胞分裂为靶点的抗肿瘤药的效率。战胜抗药性的潜在方式之一就是唤醒这些休眠的肿瘤细胞。研究显示，OGF-OGFr通路联合化疗对多种癌细胞，包括胰腺癌、乳腺癌均能起到叠加的生长抑制作用〔16,19〕。甲基纳曲酮(MNTX)能够通过阻断细胞生长抑制通路加强多西紫杉醇(DOC)的作用。编码OGF的PENK，其主要在弥漫性胃癌中表达，能抑制细胞生长。MNTX阻断OGF通路的作用使细胞从被捕获状态释放，并且增强了DOC的作用。与单独应用DOC比较，两者联合应用显著地延长生存期，减轻腹痛，并减轻DOC抗药性〔23〕。研究显示MNTX阻断OGF-OGFr通路能增强抗癌药DOC的作用，为减轻化疗药的毒性及增强疗效提供了新的启示。MNTX对更多药物的作用及其详细作用机制尚需进一步研究。

4 OGF-OGFr通路的调节

Imiquimod是低分子量的免疫反应调节剂。有研究观察了T细胞免疫缺陷的裸鼠和免疫功能正常的C57BL/6鼠，局部应用Imiquimod后皮肤基底细胞DNA合成的变化。Imiquimod对裸鼠和C57BL/6鼠的DNA合成都显示了相似的抑制功能。使用Imiquimod后，基底细胞中OGF和OGFr的表达都上调。在Imiquimod作用下，细胞DNA合成受到抑制，并且从第3天持续到第5天。DNA合成量的变化在第1,3,6天是相似的。naloxone能阻断Imiquimod的作用。Imiquimod联合OGF或LDN，比单独应用并不能产生增强的抑制作用。伤害性测试显示，Imiquimod既不是OGFr激动剂也不是拮抗剂，更不诱导凋亡或坏死〔24〕。结果提示Imiquimod对DNA合成的作用是依靠OGFr受体的介导，Imiquimod依靠OGF-OGFr通路调节细胞增殖。

用组织培养的除去了免疫体系的干扰及Toll样受体的胰腺癌、大肠癌、SCCHN细胞，均显示咪唑并喹啉(Imidazoquinolines)上调OGFr，随之刺激OGF-OGFr通路的相互作用。继而，通过调节细胞周期依赖性激酶抑制剂强力的激活调节细胞增殖抑制通路，导致细胞周期阻滞在G(1)-S期。中和OGF和(或)通过siRNA敲除OGFr能够除去Imidazoquinolines对细胞增殖的抑制作用〔25〕。利用此种药物能够加强OGF-OGFr通路的作用,有重要的实用意义，但其详细机制仍不清楚，需要进一步研究。至于其他的调节剂及其调节机制则需要进一步发现和研究。

5 OGF-OGFr通路的局限性

在癌症数据库中体细胞突变目录中存在OGFr 13错义突变。R444H和S378I，两个突变位点被确认，它们与调节OGFr转运到核内和改变其DNA合成的功能属性有关。R444H显示其核质比明显减少，而S378I却没有变化。两种突变的细胞都显示出对OGF和长效拮抗剂naltrexone(NTX)缺乏反应。仅有R444H显示了BrdU标记的抑制活性的缺失，还没有确认是何种突变或突变如何改变OGF的抑制活性〔26〕。显示OGFr的完整性对于用OGF进行生物治疗的充分反应是必须的。找出肿瘤中影响治疗反应的潜在的突变非常重要。

OGF-OGFr通路广泛存在，对细胞存在着剂量依赖的、可逆的、受体介导、无细胞毒性的生长抑制作用，这无疑对肿瘤的生物治疗有重要意义。但还需要对更多不同组织学类型和分化程度的癌症进一步研究以积累更多的经验。OGF-OGFr通路与更多治疗方法的联合应用效果及如何应用尚不明确。由于OGFr的突变会影响此通路的功能，这也使它在治疗中的应用受到限制。随着相应研究的深入和技术手段的进步，关于此通路更多的研究进展会被不断发现，其局限性也将被逐渐克服，OGF-OGFr通路会在肿瘤治疗中发挥更大的作用。