4个楸树品种组培快繁能力的比较研究

孟 路，刘 勇，王小平，李进宇，贺国鑫，薛敦孟，邢丽霞，李世安

（1.北京林业大学 a.林学院；b.省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083；2.北京市园林绿化局，北京 100029；3.北京市园林科学研究院，北京 100102；4.北京市大东流苗圃，北京 102200）

楸树Catalpa bungei是紫葳科梓树属的落叶乔木，原产我国，自古就有“木王”之美称，其材质优良，用途广泛，树体高大，树姿优美，集用材、观赏、环保等优点于一身，是我国特有的优质用材、药用和园林观赏树种[1]。由于楸树是异花（或异株）授粉，结实很少，发芽率低，出苗率也很低，育苗生长慢，实生繁殖较为困难[2]，大规模繁育楸树苗多以无性繁殖技术为主，主要有扦插、嫁接、组织培养3 种方法。现阶段我国关于楸树扦插的研究相对较少，楸树扦插成活效果并不乐观，楸树嫁接育苗存在成本高、生产周期长和后期生长表现衰退等缺点，难以满足短期内提供大量苗木的需求[3]，因此组织培养方法更适合楸树快速发展的需要。通过组织培养方法对楸树良种进行快繁研究，建立完整的楸树组织培养快繁体系，具有繁殖快，繁殖系数高，不受场地、季节和环境条件限制等诸多优点[4]，适于楸树良种工厂化育苗及产业化发展。

为解决楸树繁殖率低的问题，已有研究者进行了部分楸树品种的组织培养繁殖技术研究［5-8］，均针对单一品种试图筛选出其最佳的组培配方，对不同品种楸树组织培养繁殖能力的差异报道较少。已有研究表明，遗传因素对楸树组培苗的繁殖生长影响显著[9]。不同楸树品种的基因型不同，其生理类型不同，植物体内源激素种类、含量也不相同，在离体培养过程中，所需的营养和外源激素用量也不一致[10]，即使在相同培养条件下，繁殖系数等也存在差异，制约了楸树优质种苗的规模化、标准化生产。因此有必要对不同楸树品种芽诱导、芽增殖、生根等能力进行对比研究，找出不同品种间离体培养条件的差异，并分别探索出各品种的最佳培养条件，为进一步优化培养基配方、改进生产工艺提供理论和技术参考[11]。

‘鲁楸1 号’Catalpa bungei‘Luqiu 1’和‘洛楸1 号’Catalpa bungei‘Luoqiu 1’分别是山东省林业科学研究院和中国林业科学研究院在多个无性系中选择出的速生型用材良种，‘云朵楸’Catalpa bungei‘Yunduo’（花色白）和‘朝霞楸’Catalpa bungei‘Zhaoxia’（花色红）是中国林业科学研究院选育出的观赏型优良品种，具有很好的推广前景和开发利用价值。

本研究选取‘朝霞楸’‘云朵楸’‘洛楸1号’和‘鲁楸1 号’4 个楸树优良品种为试材，研究组织培养过程中不同质量浓度6-BA 对丛生芽诱导、增殖培养的影响，生长素NAA 和IBA 在生根阶段的效果等，并对不同楸树品种在诱导、增殖、生根阶段的差异性进行了对比分析，筛选出楸树4个品种在诱导、增殖、生根阶段的最佳培养基配方，分别建立了相应的快繁技术体系，加强楸树优良种质资源保存与应用，以期为今后楸树良种产业化生产和繁育提供理论借鉴和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验地点与外植体材料

试验地点为北京市大东流苗圃的组培室。试验材料为栽培在北京市大东流苗圃资源地的2年生楸树小苗，选取的优良品种为‘洛楸1 号’‘朝霞楸’‘云朵楸’和‘鲁楸1 号’，采其平茬后的当年生萌生条为外植体材料。

1.1.2 试验试剂

所用基本培养基MS、DKW、WPM 均为Phyto Technology Laboratories（简 称Phy-to Tech）提供；凝固剂琼脂，产于Microanalysisinc 的Agar Powder；细胞分裂素使用6-苄氨基嘌呤（6-BA 即6-Benzyil aminopu-rine）；生长素类似物使用a-萘乙酸（NAA 即a-Naphthalene acetic acid）和3-吲哚丁酸（IBA 即Indole-3-butyric acid）。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的获得

2017年5月中旬的晴天取材，选取长势良好的‘朝霞楸’‘云朵楸’‘洛楸1 号’和‘鲁楸1 号’的当年生枝条，取距顶芽10 cm 内的幼嫩茎段作为外植体材料，剪去叶片，保留0.5 cm 长的叶柄，剪成5 cm 左右的带腋芽茎段，用软刷轻轻刷洗外植体表面，流水冲洗，去除附着在外植体表面的尘土和部分菌体，将外植体放入大玻璃烧杯中，加入少量洗洁精浸泡30 min 后,流水冲洗1 h。沥水后，在超净工作台上消毒灭菌处理。先用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3 次，再用10%次氯酸钠溶液消毒8 min，无菌水冲洗5 次，用无菌刀切成1.5 cm 左右的带腋芽茎段，即可接种到预先配好的诱导培养基中培养。

1.2.2 基本培养基与培养条件

诱导阶段基本培养基为MS 培养基，增殖阶段基本培养基为DKW 培养基，均附加30 g/L 的蔗糖和5.5 g/L 的琼脂；生根阶段基本培养基为WPM 培养基，附加20 g/L 的蔗糖和5.0 g/L 的琼脂；pH 值调至5.8；121 ℃高压灭菌20 min；培养室温度25±2 ℃；光照强度1 500～2 000 lx；光照时间12 h/d。

1.2.3 植物外源激素的处理方法

1.2.3.1 6-BA 对不同品种楸树丛生芽诱导的影响

将灭菌过的4 个楸树品种茎段分别接种在以下3 种诱导培养基上，即以MS 为基本培养基，分别添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的6-BA，同时添加IBA 0.1 mg/L，研究不同质量浓度6-BA 对楸树丛生芽诱导的影响，各品种每处理接种20 瓶，每瓶接种3 个外植体，30 d 后统计诱导情况。

1.2.3.2 6-BA 对不同品种楸树丛生芽增殖的影响

通过预试验可知，以DKW 为基本培养基，在IBA 0.3 mg/L 处理下4 个楸树品种生长状态均良好。故采用单因素试验，研究不同质量浓度6-BA对丛生芽增殖的影响，设4 个处理，分别添加1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L 的6-BA，同时添加IBA 0.3 mg/L。切取2.0 cm 左右的无菌苗茎尖或带腋芽茎段，接种于上述4 种培养基上进行恒温光照培养。各品种每处理接种20 瓶，每瓶接种3 个外植体，30 d后统计增殖系数及生长情况。

为研究不同品种（基因型）对丛生芽增殖培养基的敏感性，分别取4 个楸树品种无菌苗的茎尖或带腋芽茎段，切成2.0 cm 左右的小段，接种到DKW ＋6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L 增殖培养基上培养，每个品种接种20 瓶，每瓶接种3 个外植体，30 d 后观察其生长情况，并统计增殖系数。

1.2.3.3 NAA 和IBA 对不同品种楸树生根的影响

继代培养结束后，取4 个品种长势一致的无菌植株为接种苗，将无根苗接种于以下8 种培养基上，即以WPM 为基本培养基，分别单独添加NAA（0.01、0.1、0.2、0.4 mg/L）和IBA（0.01、0.1、0.2、0.4 mg/L），共8 个处理，每个处理接种20 瓶，每瓶3个无根苗。培养30 d后统计各处理的生根率、根长、根数。

1.3 测定指标

培养30 d 后统计4 个楸树品种各处理的诱导率、增殖系数、生根率、平均根长及平均根数等指标。指标计算方法如下：

生根率=生根苗数/接种苗数×100%；

平均根数=总根数/生根苗数；

平均根长=总根长/生根条数。

1.4 统计分析

用Excel 软件对测定数据进行处理，对诱导率、增殖系数、生根率、平均根数、平均根长等指标结果采用SPSS 统计分析软件进行方差分析，用Duncan 方法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度6-BA 对4 个楸树品种丛生芽诱导的影响

接种5 d 左右，大部分外植体开始生出小芽。表1 结果显示，在含IBA 0.1 mg/L 的培养基中，添加不同质量浓度的6-BA 对楸树4 个品种的丛生芽诱导的促进作用存在着一定的差异：‘洛楸1号’和‘鲁楸1 号’的诱导率随6-BA 质量浓度的增加呈下降趋势，6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L 组 合效果最佳，与其他处理相比差异性极显著 （P＜0.01），同时芽苗生长茁壮，长势最好，诱导率均达100.00%；‘朝霞楸’和‘云朵楸’的诱导率随6-BA 质量浓度的增加呈先增后减的趋势，不同处理质量浓度间均达到极显著差异 （P＜0.01），6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L 组合效果最佳，诱导率依次为100.00%、81.82%。

表1 不同质量浓度6-BA 对4 个楸树品种丛生芽诱导的影响†Table 1 Effects of different concentrations of 6-BA and IBA 0.1mg/L on the germination of axillary buds from Catalpa bungei

2.2 不同质量浓度6-BA 对4 个楸树品种丛生芽增殖的影响

表2 表明，在含IBA 0.3 mg/L 的培养基中，添加不同质量浓度6-BA 对楸树4 个品种的增殖系数均有明显影响，随着处理质量浓度的增大，‘洛楸1 号’的增殖系数逐渐减小，‘朝霞楸’的增殖系数逐渐增大，‘云朵楸’和‘鲁楸1 号’的增殖系数呈先增大后减小的趋势。

在6-BA 1.0 mg/L 处理下，‘洛楸1 号’的增殖系数最大，为4.70，与6-BA 3.0 mg/L 处理相比差异性极显著（P＜0.01），无菌苗生长良好，叶色绿；在6-BA 3.0 mg/L 处理下，‘朝霞楸’增殖系数最大，为5.49，与其他质量浓度处理相比差异性均极显著（P＜0.01），无菌苗生长良好，说明高质量浓度6-BA 更适合‘朝霞楸’增殖；‘云朵楸’在6-BA 1.5 mg/L 处理下增殖系数最大，为3.38，与6-BA 2.0 mg/L、6-BA 3.0 mg/L 处理间差异性均不显著，但与6-BA 1.0 mg/L 处理间差异性显著（P＜0.05），且无菌苗生长良好，叶色绿；‘鲁楸1 号’在6-BA 1.5 mg/L 处理下增殖系数最大，为5.68，与其他质量浓度处理间差异性均达到极显著水平（P＜0.01）。

表2 不同质量浓度6-BA 处理对4 个楸树品种丛生芽增殖 的影响Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA on the proliferation of adventitious bud of Catalpa bungei

2.3 不同楸树品种丛生芽增殖的差异

相同处理下，增殖系数较高的是‘鲁楸1 号’，为4.54；最低的是‘云朵楸’，为2.94。4 个品种楸树增殖系数排序为‘鲁楸1号’＞‘洛楸1 号’＞ ‘朝霞楸’＞‘云朵楸’。‘鲁楸1 号’的增殖系数与‘云朵楸’存在极显著性差异（P＜0.01），与‘朝霞楸’‘洛楸1 号’均存在显著性差异 （P＜0.05）；‘洛楸1 号’增殖系数与‘朝霞楸’差异性不显著，但与‘云朵楸’差异性显著 （P＜0.05）；‘朝霞楸’增殖系数与‘云朵楸’差异性不显著。‘鲁楸1 号’新生芽茁壮，长势旺盛，叶色浓绿，‘云朵楸’新生芽中有黒尖现象，且有苗生长缓慢（表3）。

表3 不同楸树品种丛生芽增殖情况对比Table 3 The contrast of different varieties of Catalpa bungei on the proliferation of adventitious buds

2.4 NAA 和IBA 对4 个楸树品种无菌苗生根的影响

不同植物生长调节物质质量浓度对4 个品种楸树生根的影响见表4。结果显示，低质量浓度生长素更利于根伸长，高质量浓度生长素更利于根数增加，相同质量浓度NAA 和IBA 对无菌苗生根的影响不同，总体来看，NAA 比IBA 更好地促进楸树4 个品种无菌苗生根。

‘洛楸1 号’生根率在各质量浓度处理间均存在极显著差异（P＜0.01），随着NAA 质量浓度的升高，生根率和平均根数有总体上升的趋势，在NAA 0.4 mg/L 处理下，生根率最高，达96.97%，平均根数最多，为14 根/株，平均根长为2.80 cm，平均根数与其他处理间相比差异性极显著（P＜0.01）。综合考虑，‘洛楸1 号’最佳生根培养基为WPM+NAA 0.4 mg/L。

NAA 0.1 mg/L 处理下，‘朝霞楸’生根率最高，达97.50%，平均根数为9.44 根/株，平均根长为3.06 cm，生根率与其他处理相比差异性极显著（P＜0.01），平均根数和平均根长也达到了较高的水平，生根效果好，因此，‘朝霞楸’最佳生根培养基为WPM+NAA 0.1 mg/L。

在NAA 0.2 mg/L 处理下，‘云朵楸’和‘鲁楸1号’的生根率最高，依次为76.67%、93.33%，与其他处理相比差异性极显著（P＜0.01）；‘云朵楸’平均根数为6.07 根/株，平均根长为 2.59 cm；‘鲁楸1 号’平均根数为5.06 根/株，平均根长为2.84 cm，根状态良好。综合考虑，‘云朵楸’和‘鲁楸1号’最佳生根培养基为：

WPM+NAA 0.2 mg/L。

表4 不同质量浓度NAA 和IBA 对不同品种楸树无菌苗生根的影响Table 4 Effect of the different combinations of NAA and IBA on the rooting of different varieties of Catalpa bungei

3 结论与讨论

本研究发现，不同品种在植株再生能力上有一定差异，‘鲁楸1 号’茎芽分化和增殖能力较强，‘云朵楸’最弱，且‘云朵楸’生根能力最差，这种差异说明楸树茎芽分化及生根能力受遗传的控制，基因型不同，在培养阶段的激素需求水平也不相同[12]，‘鲁楸1 号’和‘洛楸1号’是在多个无性系中选择出的优良速生型品种，‘云朵楸’（花色白）和‘朝霞楸’（花色红）是自然选优育出的观赏型品种，品种间基因型存在差异，对激素条件的反应也不相同。所以，在生产不同基因型品种楸树种苗时，若使用同一激素组合及质量浓度的培养基快繁，可能会造成部分品种繁殖系数达不到最佳状态。因此，应针对特定品种采用相应培养配方。

植物组织离体培养过程中，特定器官或细胞是否表达全能性主要取决于是否具有适宜的激素诱导[13]，激素种类及质量浓度对外植体的萌发有重要影响[14]，只有细胞分裂素与生长素在适当的比例下才能有较高的诱导率[15]，有研究表明，不同品种的外植体其内源激素水平有较大差异[16-17]，因此所需要的外源生长调节物质也可能不同。本研究中，在含IBA 0.1 mg/L 的培养基中，不同品种楸树最适宜丛生芽诱导的6-BA 质量浓度存在一定差异，‘洛楸1 号’和‘鲁楸1 号’在6-BA 质量浓度为1.0 mg/L 时诱导率最高，‘朝霞楸’和‘云朵楸’则在6-BA 质量浓度为2.0 mg/L 时诱导率最高。但对于4 个品种而言，低质量浓度的6-BA更适合丛生芽的诱导，低质量浓度的6-BA 和IBA 0.1 mg/L 搭配，已能满足芽的分化和生长，当6-BA质量浓度为3.0 mg/L 时，4 个品种的诱导率均开始大幅下降，说明6-BA 质量浓度过高反而抑制了芽的再生。

增殖培养是组培的重要步骤，其中增殖系数是衡量繁殖快慢的一个重要指标[18]，它的高低直接受到激素的影响[19]，激素对植物器官的分化和生长发育起着至关重要的作用，在丛生芽增殖阶段，‘洛楸1 号’在6-BA 1.0 mg/L 处理下的增殖系数最大，‘云朵楸’和‘鲁楸1号’增殖系数在6-BA质量浓度增至1.5 mg/L 时达到最大，而‘朝霞楸’丛生芽的增殖则比较适合在6-BA 3.0 mg/L 培养条件下进行，将楸树4 个品种放入同一增殖培养基中培养，‘鲁楸1 号’增殖系数最高，为4.54，‘云朵楸’增殖系数最低，为2.94。植物组培繁殖系数受到植物激素质量浓度的显著影响，且增殖系数在不同品种间表现出显著差异，不同品系或栽培品种对培养条件的反应差异，说明植物材料的基因型也是影响增殖系数的重要因素。由于外植体基因型不同，在增殖培养阶段所需的最佳外源激素用量也存在差异。因此，培养基配方需要根据不同品种的特性进行优化。

已有研究表明，品种生根能力受到较强的遗传控制[20]。本研究中楸树4 个品种在生根培养基中培养，其生根效果均达到较优水平，但不同品种之间的最佳生根状况存在一定差异，各品种生根率随生长素质量浓度的增加呈不同的变化趋势。NAA 质量浓度为0.1 mg/L 时，‘朝霞楸’生根效果最好，NAA 0.2 mg/L 最适于‘云朵楸’和‘鲁楸1 号’的生根，NAA 0.4 mg/L 最适于‘洛楸1号’的生根。在诱导楸树无菌苗不定根的形成过程中发现，低质量浓度的生长素更有利于楸树幼苗根的伸长，在0.01 mg/L 的NAA 或IBA 处理下，4 个品种楸树无菌苗的平均根长均大于其他高质量浓度处理，但较高质量浓度的生长素能促进生根数的增加，因此，应根据生根率和移栽成活所需的根长、根数等综合考虑，选择合适的生长素质量浓度。比较相同质量浓度的NAA 和IBA 对无菌苗生根的效果，发现NAA 比IBA 能更好地促进楸树4 个品种的生根，其生根率、平均根数以及不定根形成能力均处于较高水平，因此，NAA 为诱导楸树无菌苗生根的最佳植物生长调节物质。

以楸树4 个品种的带腋芽茎段为外植体，对4 个品种植株的诱导、增殖能力和生根能力进行了对比研究，结果表明，4 个品种楸树通过离体培养途径均能再生植株，最佳增殖系数均达到 3 以上，生根效果较好。由于遗传基因的控制，不同品种的芽增殖能力存在差异，在离体诱导、增殖和生根过程中所需的外源激素用量也存在差异，分别建立了4 个优良品种的离体快繁技术体系。‘洛楸1 号’最佳培养基组成：诱导阶段为MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1 mg/L，增殖阶段为DKW+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.3 mg/L，生根阶段为 WPM+NAA 0.4 mg/L。‘朝霞楸’最佳培养基组成：诱导阶段为MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，增殖阶段为DKW+6-BA 3.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L，生根阶段为WPM+NAA 0.1 mg/L。‘云朵楸’最佳培养基组成：诱导阶段为MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，增殖阶段为DKW+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.3 mg/L，生根阶段为WPM+ NAA 0.2 mg/L。‘鲁楸1 号’最佳基组成：诱导阶段为MS+6-BA 1.0 mg/L+ IBA 0.1 mg/L，增殖阶段为DKW+6-BA 1.5 mg/L+ IBA 0.3 mg/L，生根阶段为WPM+NAA 0.2 mg/L。

在研究初期需要大量的外植体进行重复试验，由于楸树资源较少，且必须选择当年生幼嫩茎段作为外植体，难以保证材料充足，因此对于4 个楸树良种的灭菌措施、诱导过程没有做更详细的研究。另外，在增殖阶段，发现在同等培养条件下，‘鲁楸1 号’生长较快，继代周期短，但没有对其生长指标和生理指标进行测定，缺少理论数据证明不同品种之间存在差异，希望在以后的研究中能够通过植物生长调节剂的处理，从细胞学、生理生化或分子机理角度，探讨不同品种再生芽形成和根分化的遗传差异，进一步优化楸树良种的离体培养体系。