液相-原子荧光（LC-AFS）联用技术测定大蒜中不同形态硒化合物含量研究

□ 钟银飞 安徽省产品质量监督检验研究院

1 前言

硒是14种人体必需微量元素之一，具有一定的营养作用。另一方面，硒过量摄入会引起人体中毒。同时，不同形态硒直接影响食品的营养价值和安全性，因此对形态硒化合物进行研究测定具有重要意义[1]。本文以大蒜为代表检测样品，对流动相浓度、pH值、流速以及在线紫外消解条件进行研究，优化液相—原子荧光（LC—AFS）联用技术检测硒代胱氨酸、亚硒酸跟、硒代蛋氨酸3种形态硒的条件，确定了最佳检测条件[2]。

2 实验部分

2.1 实验仪器

SA720原子荧光形态分析仪、pH酸度计、氮吹仪、纯水机与电子天平。

2.2 试剂

亚硒酸根标准溶液（GBW10032，购于中国计量科学研究院）：浓度为68.9 μg/g，以亚硒酸根计。

硒代胱氨酸标准溶液（GBW10087，购于中国计量科学研究院）：浓度为93.5 μg/g，以硒代胱氨酸计。

硒代蛋氨酸标准溶液（GBW10034，购于中国计量科学研究院）：浓度为97.9 μg/g，以硒代蛋氨酸计。

流动相：称取6.8 g优级纯磷酸氢二铵，溶解于一级水，定容于1 000 mL，用氨水调节pH值为6.0，配制成60 mmol/L的磷酸氢二铵溶液。

还原剂：2.0%KBH4（m/v）+0.5%KOH（m/v）+0.4%KI（m/v）；载流：15%盐酸（v/v）。

2.3 色谱条件及荧光条件

色谱柱：PRP—X100阴离子交换柱（250 mm×4.0 mm）及保护柱（25 mm×4.0 mm）；流动相：60 mmol/L磷酸氢二铵溶液，流速1.2 mL/min，进样体积200 μL。荧光条件：倍增管高压：280 V；灯电流：50/50 mA；炉温：280 ℃；载气：300 mL/min；屏蔽气：600 mL/min；在线紫外消解[3]。

2.4 标准曲线的绘制

将3种形态硒标准物质，用一级水溶解定容到棕色容量瓶中，分别配制成标准溶液母液。临用前，用移液器移取一定量的3种形态硒标准溶液用二次去离子溶解定容到棕色容量瓶中配制成系列溶度的标准溶液，浓度分别为硒代胱氨酸145、290、435、580 μg/L 和 725 μg/L， 亚 硒 酸 根 43、86、129、172 μg/L 和 215 μg/L，硒代蛋氨酸 119、238、357、476 μg/L与595 μg/L。依次进样，绘制成标准曲线（需当天配制）。

2.5 样品前处理和检测

称取粉碎后的大蒜样品5 g于50 mL离心管中，向样品中加入15 mL甲醇水（1∶2）溶液，涡旋混匀，超声提取20 min，离心10 min（8 000 r/min），离心后将上清液转移至10 mL比色管中；重复上述步骤，合并上清液，氮吹浓缩，将浓缩后的溶液加一级水定容至10 mL，过0.45 μm滤膜备用，标准溶液进样完成后上机检测。

2.6 计算

按式（1）计算试样中各种形态硒的含量。

C=(A×V×D)/(W×1000) （1）

式（1）中：C为形态硒含量，单位mg/kg；A为测得样液中浓度，单位μg/L；V为样液定容体积，单位mL；W为样品称量，单位g；D为稀释因子。

3 结果与讨论

3.1 色谱分离情况

硒代胱氨酸保留时间2.6 min、亚硒酸根保留时间4.4 min、硒代蛋氨酸保留时间6.0 min，3种形态硒标准溶液的分离色谱图详见图1。

3.2 检测条件的优化

3.2.1 流动相浓度

以40～80 mmol/L浓度范围的磷酸氢二铵溶液为流动相，考察流动相浓度对形态硒分离和响应值的影响。当浓度小于50 mmol/L时，3种形态硒保留时间延长且峰形展宽；当浓度大于50 mmol/L时，3种形态硒保留时间保留时间变短；当浓度大于60 mmol/L时色谱峰重叠，分离度变差；当浓度为60 mmol/L时3种形态硒能够在8 min内实现有效分离。

3.2.2 流动相pH

图1 硒代胱氨酸、亚硒酸跟、硒代蛋氨酸等三种形态硒标准溶液分离色谱图

配制60 mmol/L磷酸氢二铵溶液流动相，用氨水调节pH值为4.5～6.5，考察不同pH对3种形态硒分离效果的影响。实验表明，当pH值降低，保留时间减少，当pH值小于5.0时，3种形态硒不能达到有效分离；当pH值增加时，保留时间增加，当pH值大于6.0后峰形变宽，灵敏度下降；当pH值为6.0时，3种形态硒能够实现有效分离。

3.2.3 流动相流速

设定流速为0.8、1.0、1.2 mL/min和1.4 mL/min进行实验，发现流速小于1.0 mL/min时，保留时间较长，峰形展宽；当流速大于1.2 mL/min后，保留时间减少，当分离度下降；当流速为1.2 mL/min时，能够在8 min内实现有效分离，分离度较好。

3.2.4 在线紫外消解

直接激发除亚硒酸根外，硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的有机硒响应信号非常低，当开启在线紫外消解功能后，有机硒响应信号显著上升，所以在形态硒检测过程中需要保证在线紫外消解效果。

3.3 方法的线性及检出限

配制不同浓度的标准溶液，在上述实验条件下找出线性范围。实验证明：硒代胱氨酸在60～720 μg/L时，峰面积与浓度呈良好的线性关系，峰面积A与浓度C的线性方程为C=2 600.240A—102 939.151，相关 系 数为0.997，检出限为60 μg/L；亚硒酸根在10～210 μg/L时，峰面积与浓度呈良好的线性关系，峰面积A与浓度C的线性方程为C=13 536.850A+36 463.015，相关系数为0.999，检出限为10 μg/L；硒代蛋氨酸在55～590 μg/L时，峰面积与浓度呈良好的线性关系，峰面积A 与浓度C的线性方程为C=1 101.099A—46 290.586，相关系数为0.999，检出限为55 μg/L。

3.4 方法的精密度及回收率

以大蒜为代表样品，添加一定量的标准物质做阳性样，按上述方法进行检测，连续进样测定8次，测定其精密度RSD，并加人适量标准溶液测定其回收率，结果见表1。

由上表可知，大蒜中硒代胱氨酸、亚硒酸根和硒代蛋氨酸的检测精密度分别为1.5%、2.8%和1.0%，回收率分别为85.3%、89.8%和83.2%，该方法具有良好的精密度和加标回收。

表1 大蒜中样品中硒代胱氨酸、亚硒酸根和硒代蛋氨酸含量测定