25-羟基维生素D测定试剂临床有效性研究

广东省药品监督管理局审评认证中心 （广东 广州 510080）

内容提要： 根据《体外诊断试剂注册管理办法》《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》及《免于进行临床试验的体外诊断试剂临床评价资料基本要求（试行）》等相关法规的内容，对25-羟基维生素D定量测定试剂盒临床有效性评价的要求进行总结归纳。

从全球医疗器械行业细分领域构成来看，用于体外诊断试剂、心血管诊断、影像诊断及骨科的医疗器械的占比较高，我国器械行业构成基本与全球基本保持一致。近年来随着国家政策及民生需求的共同驱动，我国医疗器械行业的发展呈总体增长态势。

提及医疗器械产品的注册上市，无论是直接参与到产品设计研究及生产、销售的工作人员，还是最终流向的医护工作人员及患者等在内的使用者/消费者，都一致希望最终成型上市的器械产品是安全且有效的。按照我国现行管理法规的分类，医疗器械大体分为有源器械、无源器械、体外诊断试剂三大类。其中体外诊断试剂相对于有源器械及无源器械而言，属于新兴行业，更是朝阳产业，发展迅速。从最早按药品管理，到如今归为医疗器械管理，相应法规及指南文件随着产业的发展，在相对独立的基础上，也越发科学专业。体外诊断试剂的使用基本上不直接接触人体，一般关注产品的安全性主要指的是生物安全性方面的防护相关措施（如是否涉及到艾滋、乙肝等传染性物质），产品的有效性则主要体现在产品使用质量的好坏，即检测结果的准确性、重复性、稳定性上。

试剂的分类多种多样，从方法学的不同可划分为层析法、液相化学发光、酶联免疫法等，从检测项目来看，更是涉及蛋白质、酶、激素、细胞因子等人体成分，以及现在大热的，也是体外诊断发展趋势的分子诊断。由于不同的检测项目其临床意义不同，故临床的使用及研究也随之存在差异。本文选取与人们日常生活密切相关的维生素中的一种25-羟基维生素D作为研究的切入点，简单阐述注册过程中定量检测试剂的临床有效性研究。

1.临床意义

众所周知，维生素D是一种脂溶性类固醇激素前体，是人体必需的脂溶性维生素之一，主要由皮肤经光照后产生。其水平受到诸多因素的影响，主要包括紫外线辐射、膳食补充、年龄和肥胖、种族和民族因素等。维生素D主要有维生素D3（胆钙化甾醇）和维生素D2（麦角钙化甾醇）两种存在形式。维生素D本身并不具有生物活性，需要发生2次羟基化，从而转化为生物活性形式。第1次羟基化发生在人体肝脏，产生25-羟基维生素D；第2次羟基化主要发生在人体肾脏，产生具有生物活性的代谢物1,25－二羟维生素D。当1,25-(OH)2D足量时，它可进一步在肾脏转化为24,25-(OH)2D，最后发生分解代谢。循环中的25-羟基维生素D的半衰期为2～3周，时间较长且具有一定的稳定性。因此，在临床医学领域，对人体血液中25-羟基维生素D的检测经常被用于确定人体内维生素D的含量。进而，血液中25-羟基维生素D的浓度被认为是体现人体维生素D状态的最佳指标，用于评估人体的营养水平及健康状态。

临床上，维生素D的缺乏与很多疾病的发生均密切相关，如一些骨骼疾病、癌症、自身免疫性疾病和心血管疾病等等。因此，及时了解人体维生素D的状态，监测人体维生素D的水平，借此实现维生素D的个体化补充对保持人类健康具有重要的意义[1]。本文选取的25-羟基维生素D定量测定试剂盒更是临床上监测人体维生素D水平的一种简单高效的诊断方式。

2.临床研究

截止2020年7月，参照现行相关法规的要求，25-羟基维生素D定量检测试剂注册过程中的临床研究可分为两条途径进行[2]。一是经医疗器械备案的临床单位进行临床试验；二是参照免临床试剂的要求自行进行临床评价。以下将细化两种临床评价途径的相关要求及注册审评过程中的关注点。

2.1 临床试验

25-羟基维生素D并非新发现的待测物质，目前已有少量同类检测试剂注册上市[3]。研究者可按照《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》三临床试验设计中（二）2“已有同品种批准上市”产品的临床试验方法选择同类产品进行比对研究，对二者平行检测的结果数据进行统计分析，从而证明考核产品的有效性；抑或选择现在临床上较为公认的质谱法进行准确性比对验证。

整个试验中，对比产品的选择是影响临床试验完成的成功与否的关键所在。参照《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》及国外系列相关EP指南文件的描述，建议在选择同类产品时，应多方面多因素综合考虑：①二者方法学是否相似，如化学发光免疫分析法与胶体金层析法是否具有可比性；②预期用途是否具有可比性，如定量产品与定性产品是否可比较；③计量单位二者是否一致，或者可进行科学计算转化，从而使所测结果具有可比性；④性能指标是否差异较大，如二者线性范围是否相差过大，互不重叠；⑤二者参考区间等是否相差甚远，以致最终检测结果的阴阳性判断完全不一致；⑥其他方面，如二者所检测的临床样本是否一致，如血液与尿液完全不同等。

为了避免上述所列问题的出现，确保临床试验的顺利进行。建议在同类产品的选择时应慎重，前期应经过调研，尽量锁定市场上公认的质量较好的一些产品，最后再通过小样本的临床预实验等研究工作来确定最终所选的临床同品种对比产品。

临床单位则需选择已在国家药品监督管理局备案成功的两家医疗器械临床机构进行（而非之前要求的临床药物基地及三甲医院）。样本量应结合考核试剂的自身情况及前期预实验等研究进行评估计算，作为第二类体外诊断试剂的25-羟基维生素D定量检测试剂，按照《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求，临床试验样本量应不低于200例，其中每家临床机构研究应不少于100例。此外，结合现实施有效行业标准YY/T 1585—2017《总25-羟基维生素D测定试剂盒（标记免疫分析法）》的要求以及25-羟基维生素D临床上极高、极低检测浓度均存在临床意义的情况，样本的浓度建议尽量均匀分布，低值及高值应覆盖[8.1,70.0]ng/mL的范围，且阳性样本例数所占比例建议不低于总样本例数的30%。

作为定量检测试剂盒，临床试验结束之后的统计分析应至少包括与对比产品的相关性及一致性两方面的研究。其中相关性一般采用原始数据与对比产品检测结果进行线性回归分析，建议相关系数r应≥0.95。一致性则结合产品临床试验的原始检测结果数据分布状态，选择适用的统计方法进行分析，如t检测，医学决定水平处的偏倚分析，秩和检验等等。

若选择与“金标准”进行比对研究，建议考虑临床诊断结果与实际检测结果之间的匹配及一致性。如检测浓度极低时，临床诊断或者临床症状上是否显示维生素D缺乏，反之亦然。

2.2 临床评价

“用于检测人体样本中25-羟基维生素D的含量，临床上主要用于维生素D缺乏相关疾病的辅助诊断，且不用于患者自测/新生儿检测”的常规方法学的25-羟基维生素D测定试剂盒属于2019年下半年发布的《免于进行临床试验体外诊断试剂目录汇总》的范畴，研究者可结合《免于进行临床试验的体外诊断试剂临床评价资料基本要求（试行）》的内容对考核产品的临床有效性进行分析研究[4,5]。

由于该待测物质目前尚无公认的参考方法及参考实验室，建议研究者选择与境内已上市的同类产品进行比较研究，从而证明二者具有等效性。

具体评价方法相对前述2.1所述的临床试验研究较为简化，研究者可结合产品的自身特点自行选择试验地点完成临床评价样本的检测。其中，同品种对比产品的选择考虑因素与前述临床试验中的考虑因素原则上保持一致，样本的数量要求则相对减少，但研究前均应使用合理的统计学方法对临床评价过程中应保证的样本量进行计算。参照《免于进行临床试验的体外诊断试剂临床评价资料基本要求（试行）》的内容，作为定量检测试剂的25-羟基维生素D测定试剂盒可研究不低于40例的样本，研究试剂与对比试剂二者同步平行进行双份测定，样本浓度均匀分布的同时，高、低值仍应覆盖2.1前述行标中[8.1,70.0]ng/mL的要求，亦可选择不少于100例样本，二者平行单次测定进行研究。

统计方法与前述临床试验研究的统计方法一致，首先应进行离群值分析，其次应对剩余有效数据进行相关性和一致性两方面的分析。比较特殊的地方在于，研究者如果选择40例样本同步双份测定平均值的方法进行研究，考虑到双份平均值会出现随机误差规避的问题，再结合临床使用中基本均为单次检测立即出结果的实际情况，后续数据分析过程中则需提高统计学的要求。具体可参考国外EP9-A2的相关内容进行统计分析，同时还应注意样本浓度分布参考区间外的例数所占比例应至少达到总样本例数的50%。

3.小结

目前从国内政策实施及行业发展层面来看，体外诊断试剂法规中涉及到注册临床方面的要求相对完善，对应的系列研究性指南文件也较为专业细化。

本文主要结合现阶段我国现行国/行标、法规要求及该25-羟基维生素D定量测定试剂盒的实际特点，对该维生素定量检测试剂注册过程中涉及到的临床有效性研究方法及注意事项进行概括总结。一方面为医疗器械上市前技术审评部门审评该类产品的临床评价注册资料提供参考，另一方面间接指导相关企业开展产品临床有效性的研究以及注册资料的撰写。