绿豆中蛋白提取技术及活性物质的研究进展

柳芬芳，李迎秋

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 食品科学与工程学院)，济南 250353)

绿豆，又称青小豆，属于菜豆豇豆属中的一个种，是亚洲最重要的豆科植物之一。绿豆的生命周期短，是我国种植的食用豆类之一。在我国有着悠久的种植历史且种植范围较广，主要集中在黄河、长江下游、华北等地区，其中以内蒙古、河南种植的面积较大。绿豆含有22%～26%的蛋白质，是一种非常重要的低成本、高营养食物，可以补充亚洲和非洲贫困人口的蛋白质缺乏[1]。绿豆也具有多种生物活性成分，如抗性淀粉、多糖、黄酮、抗真菌蛋白等，这些生物活性物质具有降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、提高免疫力等功效[2]，还具有健脾利尿、清热解毒、活血化脓的保健功能。目前市场上的绿豆制品很多，如绿豆蛋白乳饮料、绿豆糕、绿豆粉皮等。此外，绿豆还可以发酵制成酱油。

绿豆蛋白除了营养属性外，还具有功能特性，如持水性、溶解性、乳化性和起泡性等。蛋白质的这些功能特性在食品的生产中发挥着重要的作用，在食品生产中的应用范围也愈加广泛。将绿豆蛋白应用于食品的生产制造中，可以改善食品的品质、营养价值和口感[3]，如：可以作为食品添加剂添加在糕点中，易于形成稳定凝胶；可以添加在香肠中，改变其水分含量和质构特性；可以添加在速冻水饺中，改善其品质和储藏性能。抗性淀粉可以添加到米粉、粉皮等食品中提高它们的弹性和咀嚼性。绿豆中的抗真菌蛋白可以作为天然的防腐剂来提高食品的保质期。绿豆中超氧化物歧化酶可以添加在保健品中提高其抗氧化作用。绿豆中的黄酮类物质可以添加在香辛料中，提高香辛料中黄酮的含量，如芫荽能作为调味品主要是由于其富含挥发油、黄酮[4-5]。绿豆中活性物质虽然丰富，但还未完全得到开发和利用。

1 绿豆蛋白的提取

在提取绿豆蛋白之前，应浸泡去除杂质、烘干水分、粉碎，最后进行过筛处理。提取方法直接影响蛋白质的含量和多肽的质量，因此绿豆蛋白提取方法的选取极其重要，目前绿豆蛋白提取的方法主要有碱提酸沉法、热水浸提法、超声波协助提取法、酶法提取、超高压辅助物理法等。

1.1 碱提酸沉法

碱提酸沉法是一种最常用的方法，根据碱提酸沉法的原理将绿豆处理成绿豆粉后，溶于一定量蒸馏水中，当pH处于碱性时，经过离心后得到的上清液就是蛋白提取液。当提取液的pH值被酸调到4时，蛋白质处在等电状态，絮状物凝集下去，通过离心后获得沉淀物，再经冷冻干燥后即得绿豆分离蛋白。

乔宁[6]利用该方法来提取制备绿豆蛋白，通过优化试验得到最优的工艺条件。在此前提下，对通过超声波等多种方法辅助提取的绿豆分离蛋白进行了研究，发现最优的方式是超声波辅助提取法。对绿豆蛋白的4种组分进行功能性研究，还探讨了该分离蛋白添加在食品中的功能效果。

Du Mengxia 等[7]对提取条件进行了优化，在料液比为1∶15.0 (mg/mL)、pH值为9.0、提取温度为40 ℃的条件下，提取绿豆分离蛋白的效率最高，为73.25%。研究了绿豆蛋白的功能特性，对其氨基酸含量进行了分析，结果表明绿豆蛋白可作为潜在的营养保健品或功能性保健食品的成分。

1.2 热水浸提法

热水浸提法主要是为防止酸碱度过大影响其生物活性而提出的一种蛋白提取法，绿豆经过除杂之后进行浸泡脱皮，把脱皮的绿豆浸泡一段时间后进行均质，然后进行离心去除淀粉，把上清液过滤掉，得到绿豆蛋白样品。

考虑到碱提酸沉法的缺点，王维坚等[8]采用热水浸提法提取绿豆蛋白，研究了单因素对提取的蛋白质含量的影响，找到了最佳的绿豆蛋白的分离浸提工艺：温度40 ℃、浸提时间2 h、料液比1∶15 (g/mL)。在该基础上，采用响应面法进一步得到最优条件：温度40 ℃、浸提时间2.3 h、料液比1∶15.3 (g/mL)，蛋白质提取量为813.24 μg/mL。

1.3 超声波辅助法

超声波是一种以振动为能量的新方法。超声波可以促进破壁产生增溶作用而被广泛应用来增加目标物质的提取率，它提取工艺流程简单、成本较低、生产周期短，并且技术可靠，可用于食品工业的大规模生产[9]。其中报道中大豆、棉籽、玉米蛋白和麦子的蛋白提取都已采用超声波辅助法，超声提取绿豆分离蛋白的研究比较少见。

张玉霞等[10]将绿豆磨成粉后脱脂，将其作为原料，采取超声波辅助法获得了绿豆分离蛋白，通过优化得出最适提取条件：超声波辅助时间为25 min，浸提温度为45 ℃，料液比为1∶12 (g/mL)，浸提pH值为8.5，蛋白质的提取率为95.1%。与单纯碱提酸沉提取法相比，经过超声处理后提取时间缩短了，提取率提高了，效率也大大提高，成本降低。

杨勇等[11]研究了超声波处理对绿豆分离蛋白的影响，发现β-折叠结构含量降低，而β-转角结构含量增加，还得知超声波后绿豆蛋白的表面疏水性、乳化性、起泡性等功能特性都得到了增强。

1.4 酶法

酶法提取蛋白，发展时间短，但在营养和风味方面保持良好，应用日益广泛。潘妍等[12]利用酶法提取了绿豆分离蛋白。先确定了效果最好的酶为碱性蛋白酶，通过单因素优化条件得：加酶量7%、料液比1∶25、时间1 h。绿豆分离蛋白功效：对酪氨酸酶的抑制作用随浓度的升高而增加，DPPH·和·OH的清除能力也随着浓度升高而增加，证实了绿豆蛋白有美白和抗氧化的功能。

李积华等[13]研究了酶法水解绿豆蛋白的工艺，从氮收率和产物风味角度选取最佳酶种为Alcalase 2.4 L FG酶，运用响应面的方法进行提取条件的优化，并研究了酶解后蛋白的动力学特性。

1.5 超高压辅助法

超高压技术(ultra high pressure processing，UHP)是一种新技术，以水或其他液体作为传压介质，对放置在密封的弹性容器内的食品进行100 MPa以上的高压处理，具有很好的作用。近几年来，超高压技术作为一种非热加工杀菌技术，应用在提取物质的一些有效成分中，与传统制取方法相比，具有消耗能量少、耗时短、需要的温度低等特点而备受关注[14]。国内外学者已先后开展了超高压技术的研究，如在食品的贮藏保鲜和杀菌方面，果酱和果汁等产品的加工方面，改良食品的物性和酒类品质等方面的研究与应用，并且取得了很好的结果。

田海娟等[15]采用超高压辅助法，通过蒸馏水的浸提得到绿豆蛋白提取液。经过单因素、正交试验优化提取条件，研究了浸提压力、加压时间、料液比、浸提温度对绿豆分离蛋白提取率的影响。得到最佳提取条件：加压压力300 MPa、加压时间6 min、浸提温度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)，绿豆活性蛋白的提取率可达79.2%。通过滤纸片法和打孔法研究了绿豆蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。该法有绿色、环保、无污染、降低能耗和成本以及浸提时间短等优点。

2 绿豆中的生物活性物质

2.1 多糖

多糖是构成人类生命活动四大基本物质之一，是一种具有生物活性的大分子物质，对维持生命体机能有重要的作用。其中，植物多糖能对免疫功能进行调节，有抗肿瘤、降血糖血脂等保健作用。近年来，开发多糖资源越来越受到关注[16]。余稳稳等[17]利用响应面优化提取去皮后绿豆仁中可溶性多糖的最佳工艺条件，得到了最佳的实验条件，在此条件下，多糖的提取率为4.32%，经过Sevag法脱蛋白后，多糖纯度达到了50.35%，其中蛋白质含量为31.26%。

钟葵等[18]研究了一种碱法提取绿豆仁中多糖(AEMP)成分，对加碱液浓度、料液比、浸提温度和浸提时间进行了优化，得最佳工艺条件。在此条件下，得到多糖的提取率为9.70 mg GE/g DW。纤维离子色谱和凝胶色谱分离纯化得到了两种多糖组分，即AEMP-1和AEMP-2。AEMP及其分离纯化组分AEMP-1和AEMP-2对羟自由基和DPPH自由基都有良好的清除效果，说明它们都具有较好的抗氧化活性。AEMP-2的抗氧化活性最强，对上述两种自由基半数抑制浓度 IC50值分别为4.71 mg/mL和1.03×10-1mg/mL，对DPPH自由基的清除效果要比对清除羟自由基的效果好，是一种天然的抗氧化剂，具有一定的开发潜力。

Jiang Lian等[19]采用纤维素酶辅助提取法和热水提取法分别从绿豆皮中提取和纯化了MBP-1和MBP-2两种水溶性多糖。热重分析表明，MBP-2比MBP-1具有更稳定的结构。相关的实验表明，它们均对DPPH、OH和ABTS+自由基有清除能力，作用效果较强。MBP-1和MBP-2还对革兰氏阳性(G+)和革兰氏阴性(G-)菌表现出一定的抗菌活性。

2.2 黄酮类化合物

研究表明，绿豆皮和绿豆仁中都含有黄酮类化合物，这种活性物质具有抗氧化、降低血糖、增强免疫力等功效。吴小勇等[20]通过 L16(44)正交试验，确定了溶剂回流提取法的工艺条件，在此前提下进一步对超声波辅助溶剂法提取的工艺条件进行了优化和效果比较。用FRAP法测定样品的抗氧化能力，两种不同的提取方法得到的产物的抗氧化能力差别不大。用DPPH法测定提取物的自由基清除能力，与VC相比，从绿豆种皮中提取的总黄酮的还原能力相当于VC的20%左右，自由基清除率与实验条件下VC的差不多。

周俊鹏等[21]研究了绿豆皮中提取的黄酮的纯化工艺，比较了4种大孔树脂对其的吸附性和解吸性。研究得到AB-8型大孔树脂的效果较好，并确定了最优的吸附条件为:上样的速度和质量浓度分别为1.98 mL/min和0.0459 mg/mL。同时得到解析液体积分数70%、洗脱速度1.98 mL/min为最优解析条件。

2.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)

唐煦等[22]从绿豆中分离纯化出了苯丙氨酸解氨酶，经过凝胶电泳和等电聚焦电泳鉴定为一条均一区带。绿豆中的PAL对小鼠淋巴细胞白血病细胞株体外抑制实验，随着酶剂量的增加和处理时间的延长，抑制作用也得到了增强。研究得出其对肿瘤细胞增殖的抑制作用与其降解肿瘤细胞生长所需要的苯丙氨酸有关。张瑜等[23]对明绿豆PAL通过硫酸铵分级和阴离子交换层析进行了分离纯化，得到PAL的纯化倍数为6.9829，蛋白质得率为4.65%，酶得率为32.45%。PAL适宜的pH范围为7.6～9.0，适宜的温度范围为35～45 ℃，明绿豆PAL催化L-苯丙氨酸反应生成反式肉桂酸，刚开始发生反应的3 h内，反应产物与反应时间基本呈线性关系。到3 h之后，反应关系曲线逐渐变平缓，测量以PAL在3 h之内的活性为基准。

2.4 超氧化物歧化酶(SOD)

超氧化物歧化酶(SOD)存在于生命体中，避免由于超氧自由基的过多积累聚合而引起病症或衰老的抗氧化金属酶。它可以保护暴露在氧环境下的细胞，主要功能是经过歧化反应催化超氧化物转化为氧气和过氧化氢。相微微等[24]研究了12个品种的绿豆中的SOD活性，首先对提取榆绿1号中SOD的工艺进行单因素试验，采用正交试验进行条件优化，得到最优条件：料液比为1∶20 (g/mL)，超声波功率为140 W，pH为7.0的缓冲液，浸提温度为60 ℃。在此条件下绿豆仁中SOD活性最高的品种是冀绿7号，而苏拉2号的SOD活性最低，在品种不同的绿豆中SOD含量存在显著差异。

符丽雪等[25]对绿豆发芽过程中SOD和蛋白质的变化规律进行研究，采用NBT光化还原法测定绿豆芽的SOD活性，并发现了SOD活力在发芽过程中的规律。在发芽3～7 d中，发芽初期到第5天时，SOD的比活力达到最大值783 U/mg，之后呈现下降趋势。在绿豆生长过程中，不同的部位呈现不同的SOD比活力；其中根部SOD的比活力最强，为1649 U/mg。而蛋白质的含量变化比较单一，在发芽过程中持续上升。

2.5 胰蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂是一种抗营养因子，维持体内动态均衡，在生物的生理系统中发挥不可替代的作用。江均平等[26]研究了其在绿豆中的含量、多型性及稳定性，明胶-PAGE活性染色结果表明：绿豆中含有M1～M44种胰蛋白酶抑制剂，其中M2为主要组分；绿豆胰蛋白酶抑制剂性质稳定，经过热处理或酸处理后，M4消失，但产生了新的活性带M5～M9。

樊艳平[27]对5个抗豆象绿豆品种的胰蛋白酶抑制剂的提取纯化和稳定性进行了研究，筛选出较强活性的胰蛋白酶抑制剂，并研究了蛋白酶抑制剂和抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫的杀菌机理以及其活性，从体内蛋白酶、代谢酶和保护酶活性以及生长发育的影响方面进行了研究。

2.6 抗性淀粉

抗性淀粉主要有预防和治疗便秘、痔疮、预防糖尿病、降血脂、预防脂肪肝、瘦身作用，同时会促进短链脂肪酸的形成，影响细菌的生长，促进维生素和矿物质的吸收。谢涛等[28]对绿豆进行了研究，通过制备和纯化获得了两种抗性淀粉，并研究了它们的一些特性。研究发现：两种抗性淀粉促进了双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖，且效果很好，达到100倍以上；抑制了大肠杆菌和产气荚膜梭菌的增殖，抑制强度好，达到了106倍；对粪肠球菌的抑制强度为10倍；而对梭状杆菌没有明显影响。

郝征红等[29]使用振动式超微粉碎技术处理使得绿豆抗性淀粉的得率提高，经过单因素条件优化确定微波糊化得到抗性淀粉最佳提取条件，为之后大规模产业化生产提供了一定的理论条件。

2.7 抗真菌蛋白

吴金鸿[30]发现绿豆浆液经过处理后，得到一个电泳纯的抗菌活性组分 pm-ns LTP1(非特异性脂转移蛋白)，经SDS-PAEG得出这是一个含二硫键的单倍体蛋白。研究表明pm-ns LTP1对真菌菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、水稻白绢病菌具有明显的抑菌效果。

在绿豆中还发现一种抗真菌蛋白植物凝集素，Del等[31]研究发现，绿豆中有一种半乳糖四聚体结合蛋白，有两种活性。结合蛋白结构随着pH的变化从四聚体变为单聚体。pH值为5.6时表现出半乳糖苷酶活性，是单聚体；pH值为7.0时表现出两种活性，是一种四聚体。

2.8 其他活性物质

绿豆中还含有一些活性物质，如酸性磷酸酶，是一种单亚基酶；如几丁质酶，是一种单倍体蛋白；如葡萄糖苷酶，绿豆中含有两种β-葡萄糖苷酶，其中一种是双亚基蛋白酶。除此以外，绿豆中还含有单宁、生物碱、皂甙等活性物质。

3 展望

绿豆是生活中常见的食用性豆科植物，蛋白含量丰富，价格低廉，有较好的开发前景。绿豆蛋白有良好的功能特性，在食品生产中的应用范围也愈加广泛。绿豆中的活性物质种类多、含量丰富，仍有其他活性物质待开发。将各种活性物质作为添加剂添加到食品中，可以改善它们的营养和口感。对研究出的活性物质进行相应的机理分析，以便进行相关食品的研发。目前，绿豆保健型食品虽然层出不穷，但国内外有关绿豆的活性成分综合利用及相关产品研究开发的较少，造成了资源浪费等现象。