miR-491-5p靶向调控SHOC2对食管鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

徐烨

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤，依据病理类型的不同可将其分为食管腺癌和食管鳞癌，其中食管鳞癌在我国约占90%[1]。食管癌具有较高的发病率，且近年来呈现增长的趋势[2]。食管癌的发生和发展是一个极其复杂的过程，涉及多种信号通路的影响，其中，表观遗传学的变化在是食管癌中的作用日益被关注[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为18～25个核苷酸的小分子单链RNA，参与调控细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为[4]。研究显示，miR-491-5p在胃癌组织中低表达，过表达miR-491-5p可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，是胃癌检测的潜在生物标志物[5]。miR-491-5p表达的上调可抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭，并诱导其凋亡[6]。目前，miR-491-5p对食管鳞癌细胞生物学行为的影响及其作用机制还未知。本研究主要探讨了miR-491-5p对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其可能作用机制，以期为食管鳞癌的靶向治疗提供一定的理论依据。

材料与方法

一、细胞和实验试剂

永生化食管上皮细胞株HET-1A（货号H-HET-1A）、人食管癌细胞株EC109（货号AC100684）、EC9706（货号CS-X0230）和KYSE510（货号CBP60459）（中国科学院上海细胞库）；胎牛血清（货号16000-044）、RPMI 1640培养基（货号C11875500BT）（美国Hyclone公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，货号298-93-1）（德国Serva公司）；二甲基亚砜（DMSO，货号0231）（美国AMRESCO公司）；LiPofectamineTM2000试剂盒（货号13778-150）、Trizol试剂（货号15596018）（美国Invitrogen公司）；Vimentin抗体（货号K200054M）（福州迈新公司）；Cyclin D1（货号ab16663）、E-cadherin抗体（货号ab1416）（美国Abcam公司）；MEK（货号sc-7985）、p-MEK（货号sc-7994-R）、ERK（货号sc-101758）、p-ERK（货号sc-101761）抗体（美国Santa Cruz公司）；逆转录试剂盒（货号218161）（美国Promega公司）；PCR试剂盒（货号K1082）（美国Fermentas公司）；Matrigel基质胶（货号356234）（美国Becton Dickinson公司）；双荧光素酶活性检测试剂盒（货号JN0184-LTA）（北京百奥莱博科技有限公司）。

二、实验方法

1.细胞培养、分组和转染：复苏永生化食管上皮细胞株HET-1A、人食管癌细胞株EC109、EC9706和KYSE510，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。以EC109细胞为研究对象进行转染。转染前1 d，EC109细胞以每孔5 000个细胞密度接种于6孔板中，待细胞融合至60%时进行转染。EC109细胞分为空白对照组：细胞不做处理，正常培养；miR-491-5p组：转染miR-491-5p模拟物（mimics）；miR-NC组：转染miR-491-5p mimics阴性对照；miR-491-5p+SHOC2过表达载体（pcDNA-SHOC2）组：共转染miR-491-5p mimics和富含亮氨酸重复蛋白SHOC2（soc-2 suppressor of clear homolog，SHOC2）过表达质粒；miR-491-5p+空载体（pcDNA）组：共转染miR-491-5p mimics和空质粒。整个转染过程严格参照LiPofectamineTM2000试剂盒操作说明书。

2.qRT-PCR检测miR-491-5p和SHOC2mRNA表达水平：收集HET-1A细胞、人食管癌细胞株EC109、EC9706和KYSE510及各组转染后的细胞，采用Trizol试剂提取细胞中总RNA。参照逆转录试剂盒操作说明，将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行扩增。PCR扩增条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共进行45个循环。分别以U6和GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算miR-491-5p和SHOC2mRNA的相对表达水平。

3.MTT检测细胞增殖活性：各组转染后的细胞，以每孔2 000个细胞接种于96孔板中，分别培养24、48和72 h。每组设置3个复孔。培养结束后，每孔加入20 μl浓度为5 g/L的MTT溶液，培养箱中继续培养4 h。吸弃培养基，每孔加入150 μl的DMSO溶液，混合均匀，于酶标仪490 nm处测定OD值。

4.Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力：细胞迁移实验：转染后的各组细胞，用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基调整浓度为1×106个/ml。取100 μl细胞悬液加入水化后的Transwell小室的上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的培养基。培养24 h后，吸弃培养基，取出上室，多聚甲醛固定、结晶紫染色15 min，与细胞核结合显紫色，PBS淋洗小室，晾干。随机选取5个视野，倒置显微镜观察、拍照和计数。细胞侵袭实验：将Matrigel基质胶与无血清培养基以1 : 8的比例稀释，铺设于Transwell小室的上室。然后取100 μl细胞悬液加入上室中，后续操作同细胞迁移实验。

5.Western Blot检测蛋白表达：RIPA裂解液提取各组处理后的细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白含量。取适量蛋白溶液，加入上样缓冲液，煮沸5 min，行10% SDS-PAGE电泳。电泳后，转至PVDF膜，放入5%脱脂牛奶中室温封闭2 h。TBST洗膜后，加入稀释后的一抗，4 ℃孵育12 h。次日，TBST洗膜，加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育2 h。TBST洗膜后，加入ECL显影液，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。以GAPDH为内参，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

7.双荧光素酶报告基因实验验证miR-491-5p和SHOC2靶向关系：靶基因预测数据库TargetScan预测miR-491-5p和SHOC2的3'UTR存在结合位点。依据结合位点的基因序列，合成SHOC2的野生型（WT）、突变型（MUT）3'UTR，然后分别将其克隆至pmir-GLO，构建pmir-GLO-SHOC2-WT和pmir-GLO-SHOC2-MUT质粒。将pmir-GLOSHOC2-WT、pmir-GLO-SHOC2-MUT质粒分别与miR-491-5p mimics、阴性对照共转染至EC109细胞。转染48 h后，参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作检测各组的荧光素酶活性，以荧光虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值表示。

三、统计学分析方法

利用SPSS 22.0软件分析实验数据。各组细胞OD值、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、Vimentin、E-cadherin以及MAPK/ERK信号通路相关蛋白水平以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、miR-491-5p与SHOC2在食管鳞癌细胞中的表达

与HET-1A细胞相比，食管鳞癌细胞EC109、EC9706和KYSE510中miR-491-5p表达水平降低（P＜0.05），SHOC2 mRNA 表达水平升高（P＜0.05）。此外，EC109细胞中miR-491-5p水平最低，SHOC2 mRNA水平最高，因此，选择EC109细胞为研究对象进行后续实验（表1）。

表1 miR-491-5p与SHOC2在食管鳞癌细胞中的表达（±s，n=3）

表1 miR-491-5p与SHOC2在食管鳞癌细胞中的表达（±s，n=3）

注：每组设置3个复孔，实验重复3次；与HET-1A细胞相比，aP＜0.05

分组 miR-491-5p SHOC2 mRNA HET-1A 1.00±0.08 1.02±0.09 EC109 0.32±0.06a 2.85±0.16a EC9706 0.62±0.10a 1.73±0.10a KYSE510 0.61±0.08a 1.45±0.06a F值 106.34 464.949 P值 ＜0.001 ＜0.001

二、miR-491-5p过表达对食管鳞癌EC109细胞增殖、迁移及侵袭的影响

图1 miR-491-5p过表达对EC109细胞迁移和侵袭的影响（结晶紫染色，×400）

与空白对照组、miR-NC组相比，miR-491-5p组 miR-491-5p水平升高（P＜0.05），表明转染成功，EC109细胞中miR-491-5p过表达。与空白对照组、miR-NC组相比，miR-491-5p组OD值、迁移和侵袭数以及CyclinD1和Vimentin蛋白水平降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平升高（P＜0.05）。与对照组相比，miR-NC组对照各检测指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。表明miR-491-5p过表达可抑制 EC109细胞的增殖、迁移和侵袭（图1～2，表2）。

三、miR-491-5p负向调控SHOC2表达

生物信息学软件预测结果显示，SHOC2的3'UTR中含有与miR-491-5p互补的核苷酸序列，提示miR-491-5p可能调控SHOC2表达（图3）。双荧光素酶报告基因实验显示，转染miR-491-5p mimics可降低转染SHOC2-WT质粒的细胞的荧光素酶活性（P＜0.05），而对转染SHOC2-MUT质粒的细胞的荧光素酶活性无显著影响（P＞0.05），表明miR-491-5p可与SHOC2的3'UTR靶向结合（表3）。miR-491-5p组 SHOC2蛋白水平低于miR-NC组（P＜0.05），而anti-miR-491-5p组SHOC2蛋白水平高于anti-miR-NC组（P＜0.05），进一步说明 miR-491-5p在EC109细胞中负调控SHOC2表达（图4，表4）。

图2 Western blot法检测各组细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达

表2 miR-491-5p过表达对食管鳞癌EC109细胞增殖、迁移及侵袭的影响（±s，n=3）

注：每组设置3个复孔，实验重复3次；与空白对照组相比，aP＜0.05

细胞活性（OD 490 nm）分组迁移细胞数 侵袭细胞数 CyclinD1 Vimentin E-cadherin miR-491-5p 24 h 48 h 72 h空白对照组 0.43±0.06 0.86±0.11 1.43±0.10 156±13.25 145±12.15 0.95±0.10 0.87±0.10 0.46±0.11 1.00±0.03 miR-NC 组 0.41±0.03 0.89±0.13 1.42±0.08 150±12.48 140±11.85 0.93±0.16 0.86±0.08 0.48±0.08 1.01±0.05 miR-491-5p 组 0.20±0.02a 0.52±0.10a 0.70±0.06a 65±10.36a 70±10.26a 0.30±0.03a 0.41±0.05a 0.89±0.13a 3.45±0.25 F值 89.449 29.238 236.565 159.440 120.706 101.071 98.619 44.924 816.432 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

四、SHOC2过表达逆转miR-491-5p过表达对食管鳞癌EC109细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用

图3 SHOC2的3'UTR中含有与miR-491-5p互补的核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告实验（±s，n=3）

表3 双荧光素酶报告实验（±s，n=3）

注：每组设置3个复孔，实验重复3次；与miR-NC组相比，aP＜0.05

分组 SHOC2-WT SHOC2-MUT miR-NC组 1.06±0.05 1.05±0.10 miR-491-5p 组 0.45±0.02a 1.02±0.06 t 值 33.982 0.772 P值 ＜0.001 0.452

图4 miR-491-5p负向调控SHOC2蛋白表达

与miR-491-5p+pcDNA组相比，miR-491-5p+pcDNA-SHOC2组OD值、迁移和侵袭数以及CyclinD1 和Vimentin 蛋白水平升高（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平降低（P＜0.05），表明 SHOC2过表达逆转了miR-491-5p过表达对EC109细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。（图5～6，表5）

表4 miR-491-5p靶向调控SHOC2表达（±s，n=3）

表4 miR-491-5p靶向调控SHOC2表达（±s，n=3）

注：每组设置3个复孔，实验重复3次；与miR-NC组相比，aP＜0.05；与anti-miR-NC 组相比，bP＜0.05

分组 SHOC2 蛋白miR-NC组 0.80±0.06 miR-491-5p组 0.25±0.02a anti-miR-NC组 0.73±0.09 anti-miR-491-5p组 0.98±0.10b F值 158.226 P值 ＜0.001

图5 Western Blot法检测各组细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达

图6 食管鳞癌EC109细胞迁移及侵袭观察（结晶紫染色，×400）

表5 SHOC2过表达逆转miR-491-5p过表达对食管鳞癌EC109细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用（±s，n=3）

表5 SHOC2过表达逆转miR-491-5p过表达对食管鳞癌EC109细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用（±s，n=3）

注：每组设置3个复孔，实验重复3次；与miR-NC组相比，aP＜0.05；与miR-491-5p+pcDNA组相比，bP＜0.05

细胞活性（OD 490 nm）分组迁移细胞数 侵袭细胞数 CyclinD1 Vimentin E-cadherin SHOC2 24 h 48 h 72 h miR-NC 组 0.42±0.05 0.89±0.13 1.42±0.08 150±12.48 140±11.85 0.97±0.08 0.98±0.06 0.46±0.08 0.81±0.10 miR-491-5p 组 0.21±0.01a 0.52±0.10a 0.70±0.06a 65±10.36a 70±10.26a 0.43±0.05a 0.35±0.05a 0.93±0.06a 0.22±0.03a miR-491-5p+pcDNA 组 0.23±0.02 0.55±0.13 0.72±0.05 68±11.52 75±13.25 0.45±0.03 0.33±0.03 0.95±0.04 0.25±0.05 miR-491-5p+pcDNA-SHOC2 组 0.38±0.05b 0.75±0.11b 1.25±0.27b 113±10.41b 115±16.57b 0.95±0.11b 0.96±0.10b 0.52±0.09b 0.76±0.03b F值 72.873 19.637 56.947 116.963 57.774 148.384 280.447 124.569 255.273 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表6 SHOC2过表达逆转miR-491-5p过表达对食管鳞癌EC109细胞MAPK/ERK信号通路的抑制作用（±s，n=3）

表6 SHOC2过表达逆转miR-491-5p过表达对食管鳞癌EC109细胞MAPK/ERK信号通路的抑制作用（±s，n=3）

注：每组设置3个复孔，实验重复3次；与miR-NC组相比，aP＜0.05；与miR-491-5p+pcDNA组相比，bP＜0.05

分组 MEK p-MEK ERK p-ERK miR-NC组 0.96±0.11 0.95±0.11 0.85±0.06 0.92±0.13 miR-491-5p 组 0.97±0.05 0.32±0.06a 0.88±0.11 0.40±0.06a miR-491-5p+pcDNA 组 0.98±0.06 0.35±0.08 0.90±0.13 0.42±0.08 miR-491-5p+pcDNA-SHOC2 组 0.93±0.16 0.90±0.10b 0.91±0.15 0.90±0.11b F值 0.384 130.766 0.457 77.046 P值 0.766 ＜0.001 0.714 ＜0.001

五、SHOC2过表达逆转miR-491-5p过表达对食管鳞癌EC109细胞MAPK/ERK信号通路的抑制作用

与miR-NC组 比，miR-491-5p组p-MEK和p-ERK蛋白水平降低（P＜0.05），表明 miR-491-5p过表达可抑制EC109细胞MEK和ERK磷酸化水平。与miR-491-5p+pcDNA组对比，miR-491-5p+pcDNA-SHOC2组 p-MEK和p-ERK 蛋白水平升高（P＜0.05），表明 SHOC2 过表达逆转了miR-491-5p过表达对EC109细胞MEK和ERK磷酸化的抑制作用（图7，表6）。

图7 Western Blot法检测各组细胞MAPK/ERK信号通路相关蛋白表达

讨 论

食管鳞癌约占食管癌的90%以上，具有较高的恶性程度[7]。侵袭和转移是大多数肿瘤患者死亡的主要原因[8]。食管鳞癌患者早期既有亲自和转移的趋势，预后较差[9]。从表观遗传学的角度探讨食管鳞癌的发生和发展及作用机制，有利于食管鳞癌的分子靶向治疗。

随着对miRNA研究的深入，发现其调控恶性肿瘤细胞的生物学行为，与肿瘤的发生和发展密切相关。研究显示，骨肉瘤细胞中miR-491-5p低表达，上调miR-491-5p表达可抑制骨肉瘤细胞的增殖，并促进其凋亡[10]。miR-491-5p在前列腺癌组织和细胞中低表达，过表达miR-491-5p降低了前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力[11]。miR-491-5p对食管癌细胞生物学行为的影响还未知。本研究结果显示，食管癌细胞中miR-491-5p表达降低，提示miR-491-5p作为抑癌基因参与食管癌的发生和发展。通过转染 miR-491-5p mimics至食管癌EC109细胞过表达miR-491-5p，结果显示，miR-491-5p过表达的EC109细胞增殖、迁移和侵袭能力降低，CyclinD1和Vimentin蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达升高，表明miR-491-5p过表达抑制了食管癌EC109细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

miRNA通过直接与靶mRNA的3'非编码区（UTR）结合，降解靶mRNA或抑制其翻译，进而调控基因的表达[12]。有报道称，SHOC2在甲状腺癌细胞中表达上调，miR-299-3p可通过抑制SHOC2表达抑制甲状腺癌细胞的增殖，阻滞细胞周期，并诱导细胞凋亡[13]。SHOC2基因位于染色体10q25，广泛表达于生物体内，参与调控细胞增殖、分化等生命过程，与肿瘤的发生发展密切相关。本研究通过生物信息学软件预测显示，SHOC2的3'UTR含有与miR-491-5p互补的核苷酸序列，推测SHOC2可能也是miR-491-5p的靶基因。双荧光素酶实验证实，miR-491-5p可与SHOC2的3'UTR靶向结合。此外，miR-491-5p过表达的EC109细胞SHOC2蛋白表达降低，而miR-491-5p表达抑制的EC109细胞SHOC2蛋白表达升高，进一步说明miR-491-5p在EC109细胞中负调控SHOC2表达。研究还显示，SHOC2过表达逆转了miR-491-5p过表达对EC109细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用，提示miR-491-5p通过负调控SHOC2表达抑制EC109细胞增殖、迁移及侵袭，为食管癌的分子靶向治疗提供了新靶点。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路是细胞因子调控细胞途径的重要通路，参与肿瘤的发生和发展[14]。研究显示，MAPK/ERK信号通路抑制剂可抑制胃癌细胞的增殖，阻滞细胞周期[15]。有报道，丙泊酚可通过抑制MAPK/ERK信号通路的活性抑制人食管癌细胞EC9706的增殖、侵袭和迁移，并促进其凋亡[16]。SHOC2可激活Ras-ERK-MAPK信号通路进而促进多种恶性肿瘤发生及发展[17]。本研究结果显示，过表达miR-491-5p降低了食管鳞癌EC109细胞中p-MEK和p-ERK蛋白表达，表明过表达miR-491-5p可抑制MAPK/ERK信号通路的活性，而SHOC2过表达逆转了miR-491-5p过表达对EC109细胞中p-MEK和p-ERK蛋白表达的抑制作用，提示过表达miR-491-5p可能通过下调SHOC2表达进而抑制MAPK/ERK信号通路的活性降低EC109细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

综上所述，食管鳞癌细胞中miR-491-5p低表达，miR-491-5p过表达可抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其可能通过下调SHOC2表达抑制MAPK/ERK信号通路的活性发挥作用。