阿司匹林联合阿托伐他汀钙对内皮细胞氧化损伤及炎症因子的影响

李万奎

目前我国心脑血管疾病的发病率逐年升高，严重威胁着人们的身体健康，影响了人们的生活质量。研究表明，动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础，其本质是一种炎性改变［1］，内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化早期的病理变化［2］，氧化低密度脂蛋白是早期内皮细胞损伤的关键性因子［3］。在动脉粥样硬化的治疗中，阿司匹林联合阿托伐他汀钙被公认为是有效的治疗方案，不仅能抑制血小板聚集、调节血脂，还对炎症因子有调节作用［4］。但在细胞水平上，阿司匹林联合阿托伐他汀钙对动脉粥样硬化的影响，目前尚未见文献报道。基于以上研究背景，该研究以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）为研究对象，用氧化低密度脂蛋白诱导其损伤，建立动脉粥样硬化模型，采用四甲基偶氮唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT 法）检测 HUVEC 增殖活力，并计算细胞存活率，检测上清液中白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β） 含 量 、 白 介 素 -6（interleukin-6，IL-6）含量、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量，来分析各组炎症指标变化，为阿司匹林联合阿托伐他汀钙治疗动脉粥样硬化疾病提供实验基础。

1 材料与方法

1.1药物试剂与动物阿司匹林标准品（中国食品药品检定研究院，批号：100113-201706）；阿托伐他汀钙标准品 （中国食品药品检定研究院，批号：100590-201804）。DMEM 培养基（GIBCO 公司，批号1279435）；胰蛋白酶（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号0458-25g）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号201804031250）；氧化低密度脂蛋白 （上海鲁汶生物科技有限公司，批号20180104）；IL-1β试剂盒 （南京建成生物工程研究所，批号20180107）；IL-6试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20180113）；TNF-α试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20180105）。清洁级健康成年 Sprague-Dawley（SD）大鼠 12只，雌雄不限，体质量 290～310 g，许可证号：SCXK（豫）2017-0001，由信阳职业技术学院实验动物中心提供，购自河南省实验动物中心；产后1 h以内新鲜脐带数根，来自河南圣德医院妇产科。

1.2方法

1.2.1 HUVEC的培养、鉴定及传代 依据文献方法及本人前期研究［5］，从健康足月产妇脐静脉内提取HUVEC，并进行传代。经Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色证实培养的细胞为内皮细胞。

1.2.2 含药血清制备 模拟人类用药方法及相关文献［6］，将12只SD大鼠分为4组，每组3只，分别以不同剂量药物灌胃：空白对照组及模型组（蒸馏水 2 ml），阿司匹林组（1 mg/ml阿司匹林溶液 2 ml），阿司匹林+阿托伐他汀钙组 （1 mg/ml阿司匹林+0.05 mg/ml阿托伐他汀钙溶液2 ml）。均灌胃3 d，于最后一次灌胃后2 h无菌条件下收集腹主动脉血，同组血液混合，离心分离血清，经56℃灭活30 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置－20℃冰箱保存备用。

1.2.3 实验分组及处理 取生长良好的3～4代传代培养的HUVEC，接种于96孔板进行培养及干预，每组重复10个复孔。待细胞生长同步化后，将细胞分为4组，分别为空白对照组、模型组、阿司匹林组、阿司匹林+阿托伐他汀钙组。空白对照组给予灌胃蒸馏水2 ml共3 d的大鼠血清DMEM培养液，模型组给予灌胃蒸馏水2 ml共3 d的大鼠血清DMEM培养液，阿司匹林组给予灌胃药物（1 mg/ml阿司匹林溶液2 ml）共3 d的大鼠血清DMEM培养液，阿司匹林+阿托伐他汀钙组给予灌胃药物（1 mg/ml阿司匹林+0.05 mg/ml阿托伐他汀钙溶液2 ml）共3 d的大鼠血清DMEM培养液。各组细胞培养24 h后弃去培养基，除空白对照组外（给予DMEM培养液），各组再给予含100 mg/L氧化低密度脂蛋白培养液，培养24 h，进行相关指标检测。实验重复3次。

1.2.4 观察指标 （1）MTT法测定细胞增殖活力及存活率。处理完各组HUVEC后，加入MTT（5 g/L）20 μl，继续孵育4 h，吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，低速震荡10 min，在酶联免疫检测仪490 nm测量各孔吸光值，结果以吸光度（OD）值表示。根据细胞增殖活力，计算存活率。（2）炎症因子指标的检测。处理完各组 HUVEC后，取出培养的细胞，吸取各组培养液，分别按IL-1β、IL-6、TNF-α 试剂盒说明书方法测定 IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.2.5 统计学处理 所有数据用SPSS 20.0软件进行统计学处理，数据以（）表示，所有资料采用Student-t检验。

2 结果

2.1对增殖活力及存活率的影响各组HUVEC增殖活力及存活率测定结果见表1：与空白对照组比较，模型组OD值明显降低（P＜0.01），存活率明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，阿司匹林组OD值明显升高（P＜0.01），存活率明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，阿司匹林+阿托伐他汀钙组OD值明显升高（P＜0.01），存活率明显升高（P＜0.01）；与阿司匹林组比较，阿司匹林+阿托伐他汀钙组OD值明显升高（P＜0.01），存活率明显升高（P＜0.01）。

2.2对炎症因子的影响各组HUVEC炎症因子指标测定结果见表2：与空白对照组比较，模型组IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明显增高 （P＜0.01）；与模型组比较，阿司匹林组IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α 含量降低（P＜0.05）；与模型组比较，阿司匹林+阿托伐他汀钙组IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明显降低 （P＜0.01）；与阿司匹林组比较，阿司匹林+阿托伐他汀钙组IL-6含量降低（P＜0.05），IL-1β 含量、TNF-α 含量明显降低（P＜0.01）。

表1 阿司匹林联合阿托伐他汀钙对氧化低密度脂蛋白诱导损伤的HUVEC增殖活力及存活率的影响（，n=10）

表1 阿司匹林联合阿托伐他汀钙对氧化低密度脂蛋白诱导损伤的HUVEC增殖活力及存活率的影响（，n=10）

注：与空白对照组比较，#P＜0.01；与模型组相比较，＊P＜0.01；与阿司匹林组比较，△P＜0.01。

组别 OD值 存活率（%）空白对照组 0.377±0.024 -模型组 0.199±0.013# 52.79#阿司匹林组 0.250±0.014＊ 66.31＊阿司匹林+阿托伐他汀钙组 0.269±0.012＊△ 71.35＊△

表2 阿司匹林联合阿托伐他汀钙对氧化低密度脂蛋白诱导损伤的 HUVEC IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的影响（pg/ml，，n=10）

表2 阿司匹林联合阿托伐他汀钙对氧化低密度脂蛋白诱导损伤的 HUVEC IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的影响（pg/ml，，n=10）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，▲P＜0.01；与阿司匹林组比较，△P＜0.05，★P＜0.01。

组别 IL-1β IL-6 TNF-α空白对照组 3.145±0，611 0.155±0.038 0.815±0.173模型组 12.701±1.691＊ 0.679±0.103＊ 1.867±0.318＊阿司匹林组 10.703±0.809# 0.552±0.085# 1.584±0.172#阿司匹林+阿托伐他汀钙组 8.661±1.335▲★ 0.454±0.084▲△ 1.091±0.231▲★

3 讨论

动脉粥样硬化专家Ross［7］明确提出“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病”，指出动脉粥样硬化是具有慢性炎症反应特征（变质、渗出、增生）的病理过程，其发展始终伴随炎症反应，这一学说最终得到确立。随着对动脉粥样硬化发生、发展研究的深入，越来越多的证据表明动脉粥样硬化与炎性反应密切相关。陈彩霞等［8］对健康对照者30例及Ⅰ～Ⅲ级颈动脉斑块各30例患者血清C-反应蛋白、TNF-α、IL-6水平进行对照比较，发现血清C-反应蛋白、TNF-α、IL-6水平与颈动脉粥样硬化斑块严重程度具有密切相关性。阿司匹林是治疗心脑血管疾病的一线药物，除了抑制血小板聚集外，还具有抗炎作用。阿托伐他汀钙为他汀类调脂药物，同样也具有抗炎作用。大量研究发现［9-11］，阿司匹林联合阿托伐他汀钙能够有效地降低脑梗死、冠心病、颈动脉粥样硬化患者血清炎症因子水平，抑制炎症反应，对预防脑梗死、冠心病、动脉粥样硬化有积极作用。

众所周知，血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化早期的关键环节，也是多种血管疾病发病和治疗的靶细胞［12］。 研究表明［13，14］，氧化低密度脂蛋白是最重要的损伤启动因子，可诱导内皮细胞发生炎症反应，使其分泌的炎症因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等升高，从而造成内皮细胞的损伤。MTT法是检测细胞损伤程度的常用方法，通过在490 nm测定其吸光度，从而反映细胞的增殖活力，并可计算细胞成活率［15］。IL-1β 主要由巨噬细胞、血管内皮细胞等分泌，当机体受到外来刺激时，IL-1β分泌量明显增加，除了损伤内皮细胞结构和功能外，还可促进IL-6等炎性介质的分泌［16］。IL-6主要由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等分泌，可引起血管内皮细胞炎性损伤，致使血管内皮结构和功能受损［17］。TNF-α是一种重要的促炎反应的细胞因子，除了直接损伤血管内皮细胞外，还可导致内皮细胞分泌活性物质的平衡失调［18］。氧化低密度脂蛋白可诱导内皮细胞IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子分泌，在其共同作用下，导致内皮细胞结构和功能紊乱，最终诱发动脉粥样硬化的发生、发展［19］。

该研究发现，模型组HUVEC的OD值明显降低，存活率明显降低，IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明显增高，说明氧化低密度脂蛋白明显抑制了血管内皮细胞的增殖活力，降低存活率，激活了细胞内炎症反应，这与肖琛等［20］研究一致。阿司匹林联合阿托伐他汀钙组细胞OD值及存活率明显升高，IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明显降低，且较阿司匹林组相比有统计学意义，说明阿司匹林联合阿托伐他汀钙可明显改善氧化低密度脂蛋白诱导损伤后血管内皮细胞的增殖活力，增加存活率，抑制了炎症反应，从而有效地保护了内皮细胞结构和功能。