miR-129-3p靶向LPAR3调控肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制

白 璐，马英杰，王郁杰

郑州人民医院消化内科，河南 郑州 450000

肝癌是全球最常见的实体恶性肿瘤之一[1]。近年来，尽管肝癌的早期诊断和辅助治疗技术迅速发展，但总体生存率仍然较低，这主要与肝癌细胞的高度侵袭性和远处转移有关。因此，阐明肝癌细胞侵袭转移的潜在机制对于开发新的治疗策略具有重要意义。miRNA是一类在转录后水平负调控基因表达的小的非编码RNA，在调控细胞的生长、分化和转移等过程中发挥重要作用[2]。miR-129-3p属于miR-129家族成员，其可通过调控其下游靶基因表达参与肿瘤的发生和转移。有研究[3]指出，miR-129-3p在转移性肝癌组织和高转移性肝癌细胞中显著下调，过表达miR-129-3p通过靶向Aurora-A可逆转上皮间质转化，抑制肝癌细胞的体外侵袭和体内转移。溶血磷脂酸受体3(LPAR3)是一种G蛋白偶联受体，在调控恶性肿瘤细胞的存活和肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用[4]。有研究[5-6]证实，LPAR3在肝癌和卵巢癌中表达上调，过表达LPAR3可促进卵巢癌细胞的增殖，但miR-129-3p靶向LPAR3调控肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制尚无报道。因此，本研究通过体外细胞实验，旨在探讨miR-129-3p靶向LPAR3调控肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料正常肝细胞HL-7702和3种肝癌细胞(SMMC-7721、HepG2和BEL-7402)均购自中国科学院上海细胞库，DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司，LipofectamineTM2000相关转染试剂和Trizol抽提试剂购自Invitrogen公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：E1910)购自Promega公司，MTT试剂、DMSO、RIPA裂解液和Western blotting相关试剂购自北京索莱宝公司，Transwell小室购自Corning公司，Matrigel基质胶购自BD公司，兔抗LPAR3抗体(货号：orb215090)购自Biorbyt公司，兔抗Cyclin D1抗体(货号：ab226977)、兔抗MMP-2抗体(货号：ab37150)、兔抗PI3K抗体(货号：ab191606)、HRP标记的羊抗兔Ⅱ抗(ab205718)和羊抗鼠Ⅱ抗(ab205719)购自Abcam公司，鼠抗β-actin抗体(货号：sc-67879)和鼠抗AKT抗体(货号：sc5298)购自Santa Cruz公司，miR-129-3p、miR-con、pcDNA-LPAR3、pcDNA、WT-LPAR3和MUT-LPAR3的构建和测序由上海生工生物公司提供。

1.2 细胞培养、转染和分组用质量浓度为100 g/L的胎牛血清DMEM培养基分别培养正常肝细胞HL-7702和3种肝癌细胞(SMMC-7721、HepG2和BEL-7402)，培养条件为37 ℃、体积分数为5% CO2的湿润培养箱。当细胞生长融合度达到80%时，胰酶消化传代。细胞转染：取对数生长期的SMMC-7721细胞，将各组SMMC-7721细胞按照5×103个/孔，200 μl/孔接种于96孔板，当细胞融合度达到50%时，按照LipofectamineTM2000转染试剂使用说明分别将miR-con、miR-129-3p模拟物分别转染SMMC-7721细胞，培养48 h后进行后续实验。为进一步验证miR-129-3p是通过调控LPAR3表达来调控SMMC-7721细胞的增殖、迁移和侵袭，在SMMC-7721细胞中同时转入miR-129-3p和pcDNA-LPAR3，检测过表达pcDNA-LPAR3能否逆转miR-129-3p对SMMC-7721细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。本实验分组如下：NC组(SMMC-7721细胞不作处理)、miR-con组(转染miR-con)、miR-129-3p组(转染miR-129-3p)、miR-129-3p+pcDNA组(miR-129-3p和pcDNA共转染)和miR-129-3p+pcDNA-LPAR3组(miR-129-3p和pcDNA-LPAR3共转染)。

1.3qRT-PCR检测依照Trizol试剂使用说明操作步骤分别提取正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞HepG2、BEL-7402及各组SMMC-7721细胞的总RNA，测定其浓度和纯度。然后利用逆转录酶将其逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。分别以U6和β-actin为内源性参照，按照公式2-ΔΔCt计算miR-129-3p和LPAR3 mRNA的相对表达量。引物序列如下：miR-129-3p-F：5′-ACACTCCAGCTGGGAAGCCCTTACCCCAA-3′，miRNA通用下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，LPAR3-F：5′-TCTTAGGAGCCTTCGTGGTGT-3′，LPAR3-R：5′-GCTGATGCTGTCCTCCAGGTA-3′，U6-F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；U6-R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；β-actin-F：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′；β-actin-R：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

1.4 双荧光素酶报告基因检测利用生物信息软件(Target Scan)预测miR-129-3p的靶基因。发现miR-129-3p与WT-LPAR3-3′UTR能够特异性结合，猜测LPAR3是miR-129-3p靶基因，随后用双荧光素酶报告基因检测实验进行验证。构建野生型WT-LPAR3和突变型MUT-LPAR3的LPAR3-3′UTR荧光素酶报告基因载体，利用LipofectamineTM2000将miR-129-3p模拟物和miR-con分别与WT-LPAR3和MUT-LPAR3共转染SMMC-7721细胞，将各组细胞置于CO2培养箱培养48 h后，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒对各组SMMC-7721细胞的荧光素酶活性进行测定。

1.5MTT法检测细胞活力分别于转染后24 h、48 h、72 h各取一组SMMC-7721细胞，向每孔中加入MTT试剂20 μl，继续培养4 h，弃去孔内上清，每孔再加入DMSO试剂150 μl，继续培养2 h，当结晶溶解后，在490 nm波长处用酶标仪检测各孔的OD值(以空白孔进行调零)，并绘制细胞生长曲线。

1.6Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力迁移实验：取转染48 h的各组SMMC-7721细胞，进行消化离心后，用无血清的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度。向Transwell下室加入500 μl质量浓度为100 g/L FBS的DMEM培养基，向上室加入200 μl(约1×105个细胞)的细胞悬液，随后将装有Transwell小室的96孔板放置于37 ℃，体积分数为5% CO2的湿润细胞培养箱中孵育24 h，然后用棉签小心擦去上室膜上未迁移的细胞，将下室膜用甲醇固定30 min。晾干后，用质量浓度为5 g/L的结晶紫溶液染色15 min。用磷酸盐缓冲液冲洗多余的染液后，于显微镜下随机选取5个不同视野观察细胞，记录细胞总数，并进行照相，取平均值即为迁移细胞数目。

侵袭实验：把基质胶Matrigel和DMEM培养液按照1∶8比例配置Matrigel胶工作液，取50 μl已配置好的Matrigel胶工作液包被于Transwell小室底部膜的上室面，室温晾干后备用，其他步骤同上述迁移实验。

1.7Westernblotting检测利用RIPA裂解液裂解各组SMMC-7721细胞，收集每组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。100 ℃ 3～5 min使细胞蛋白充分变性，取30 μg已变性的蛋白样品上样至加样孔，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将已分离的细胞蛋白从PAGE胶转到PVDF膜，转膜结束后，用Western blotting封闭液室温摇床封闭30 min，弃去封闭液后，用Western blotting洗涤液洗膜10 min，共洗3次，然后加入稀释好的抗LPAR3、β-actin、CyclinD1、MMP-2、PI3K和AKT蛋白的一抗，4 ℃孵育过夜后，用Western blotting洗涤液洗膜3次后，加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，然后进行ECL显影和拍照，以β-actin为内参，用Image J软件对目的条带灰度值进行分析。

2 结果

2.1miR-129-3p和LPAR3在人正常肝细胞与人肝癌细胞中的表达与人正常肝细胞HL-7702相比，人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2和BEL-7402中miR-129-3p的表达显著降低，LPAR3 mRNA和LPAR3蛋白的表达显著升高(P<0.05，见图1)。表明miR-129-3p在肝癌细胞中呈低表达，LPAR3呈高表达。

注：与HL-7702组比较，*P<0.05。

图1 检测miR-129-3p和LPAR3在人正常肝细胞与人肝癌细胞中的表达A：qRT-PCR检测人正常肝细胞HL-7702和人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2和BEL-7402中miR-129-3p的表达；B：qRT-PCR检测人正常肝细胞HL-7702和人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2和BEL-7402中LPAR3 mRNA的表达；C～D：Western blotting检测人正常肝细胞HL-7702和人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2和BEL-7402中LPAR3 蛋白的表达

Fig1ExpressionsofmiR-129-3pandLPAR3inhumannormalhepatocytesandhumanhepatomacellsA:qRT-PCR detection of miR-129-3p expression in human normal liver cell line HL-7702 and human hepatoma cell line SMMC-7721, HepG2 and BEL-7402;B: qRT-PCR detection of LPAR3 mRNA expression in human normal liver cell line HL-7702 and human hepatoma cell line SMMC-7721, HepG2 and BEL-7402;C-D: Western blotting detection of LPAR3 protein expression in human normal liver cell line HL-7702 and human hepatoma cell line SMMC-7721, HepG2 and BEL-7402

2.2 转染miR-129-3p抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖与NC组和miR-con组相比较，miR-129-3p组肝癌细胞SMMC-7721中miR-129-3p的表达显著升高，Cyclin D1的表达显著降低，SMMC-7721细胞在24 h的细胞活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h时细胞活力显著降低(P<0.05,见图2)。表明成功构建了过表达miR-129-3p的SMMC-7721细胞株，过表达miR-129-3p可抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖。

注：与miR-con组比较，*P<0.05。

图2 检测肝癌细胞SMMC-7721中细胞增殖及CyclinD1的表达A：qRT-PCR检测人肝癌细胞SMMC-7721中miR-129-3p的表达；B：MTT检测人肝癌细胞SMMC-7721细胞活力；C～D：Western blotting检测人肝癌细胞SMMC-7721中Cyclin D1蛋白的表达

Fig2DetectionofcellproliferationandexpressionofCyclinD1inhepatocellularcarcinomacelllineSMMC-7721A: qRT-PCR detection of miR-129-3p expression in human hepatoma cell line SMMC-7721; B: MTT assay for viability of human hepatoma cell line SMMC-7721; C-D: Western blotting detection of Cyclin D1 protein expression in human hepatoma cell line SMMC-7721

2.3miR-129-3p过表达对肝癌细胞SMMC-7721迁移侵袭和迁移相关蛋白表达的影响与NC组和miR-con组相比，miR-129-3p组SMMC-7721细胞迁移和侵袭细胞数目显著减少，迁移相关蛋白MMP-2的表达显著降低(P<0.05，见图3)。表明过表达miR-129-3p可抑制肝癌细胞SMMC-7721的迁移和侵袭。

图3 检测肝癌细胞SMMC-7721迁移和侵袭数及迁移相关蛋白MMP-2的表达A～B: Transwell法检测人肝癌细胞SMMC-7721迁移和侵袭能力；C～D：Western blotting检测人肝癌细胞SMMC-7721中MMP-2蛋白的表达

Fig3DetectionofmigrationandinvasionnumberofSMMC-7721cellsandexpressionofmigration-relatedproteinMMP-2A-B: Transwell assay for detection of migration and invasion of human hepatoma cell line SMMC-7721; C-D: Western blotting detection of MMP-2 protein expression in human hepatoma cell line SMMC-7721

2.4miR-129-3p靶向调控LPAR3的表达miR-129-3p的5′端与LPAR3-WT-3′UTR存在特异性结合位点(见图4A)。野生型LPAR3荧光素酶表达载体WT-LPAR3分别与miR-129-3p模拟物或miR-con共转染SMMC-7721细胞后，miR-129-3p组SMMC-7721细胞荧光素酶活性较miR-con组明显降低(P<0.05)；而突变型LPAR3荧光素酶表达载体MUT-LPAR3与miR-129-3p模拟物或miR-con共转染SMMC-7721细胞后，miR-129-3p组SMMC-7721细胞荧光素酶活性较miR-con组变化差异无统计学意义(P>0.05)(见图4B)。与miR-con组相比，miR-129-3p组SMMC-7721细胞LPAR3的表达显著降低；与anti-miR-con组相比，miR-129-3p组SMMC-7721细胞LPAR3的表达显著升高(P<0.05)(见图4C)。提示LPAR3是miR-129-3p的靶基因，miR-129-3p可负性调控LPAR3的表达。

注：与miR-con组比较，*P<0.05；与anti-miR-con组比较，#P<0.05。

图4miR-129-3p靶向调控LPAR3的表达A：miR-129-3p与LPAR3的互补序列及LPAR3突变型序列；B：荧光素酶实验检查miR-129-3p与LPAR3的靶向关系；C：Western blotting检测人肝癌细胞SMMC-7721中LPAR3蛋白的表达

Fig4miR-129-3ptargetedregulationofLPAR3expressionA: the complement of miR-129-3p and LPAR3 and the sequence of LPAR3 mutant; B: Luciferase assay to examine the targeting relationship between miR-129-3p and LPAR3; C: Western blotting detection of LPAR3 protein expression in human hepatoma cell line SMMC-7721

2.5 过表达LPAR3可以部分逆转miR-129-3p对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移和侵袭的抑制作用与miR-con组比较，miR-129-3p组SMMC-7721细胞在24 h的细胞活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h时细胞活力显著降低，SMMC-7721细胞迁移和侵袭数目显著减少，LPAR3、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表达显著降低(P<0.05)；与miR-129-3p+pcDNA组比较，miR-129-3p+pcDNA-LPAR3组SMMC-7721细胞在24 h的细胞活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h时细胞活力显著升高，SMMC-7721细胞迁移和侵袭数目显著增多，LPAR3、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表达显著升高(P<0.05，见图5)。以上结果表明，过表达LPAR3可以部分逆转miR-129-3p对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

2.6miR-129-3p调控LPAR3影响肝癌细胞SMMC-7721中AKT信号通路与miR-con组比较，miR-129-3p组SMMC-7721细胞PI3K和AKT的表达显著降低(P<0.05)；与miR-129-3p+pcDNA组比较，miR-129-3p+pcDNA-LPAR3组SMMC-7721细胞PI3K和AKT的表达显著增加(P<0.05，见图6)。表明miR-129-3p调控LPAR3表达抑制肝癌细胞SMMC-7721中AKT信号通路的活化。

注：与miR-con组比较，*P<0.05；与miR-129-3p+pcDNA组比较，#P<0.05。

图5 过表达LPAR3可以部分逆转miR-129-3p对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移和侵袭的抑制作用A：MTT检测人肝癌细胞SMMC-7721细胞活力；B～C：Transwell法检测人肝癌细胞SMMC-7721迁移和侵袭能力；D～E：Western blotting检测人肝癌细胞SMMC-7721中LPAR3、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表达

Fig5OverexpressionofLPAR3partiallyreversedtheinhibitoryeffectofmiR-129-3ponproliferation,migrationandinvasionofhepatomacelllineSMMC-7721A: MTT assay detected cell viability of human hepatoma cell line SMMC-7721; B-C: Transwell assay detected the migration and invasion of human hepatoma cell line SMMC-7721; D-E: Western blotting detection of LPAR3, Cyclin D1 and MMP-2 protein expression in human hepatoma cell line SMMC-7721

注：与miR-con组比较，*P<0.05；与miR-129-3p+pcDNA组比较，#P<0.05。

图6miR-129-3p抑制肝癌细胞SMMC-7721中AKT信号通路而LPAR3可以激活此通路A～B：Western blotting检测人肝癌细胞SMMC-7721中PI3K和AKT蛋白的表达

Fig6miR-129-3pinhibitedtheAKTsignalingpathwayinhepatomacelllineSMMC-7721andLPAR3activatedthispathwayA-B: Western blotting detected the expressions of PI3K and AKT proteins in human hepatoma cell line SMMC-7721

3 讨论

miR-129家族包括miR-129-1和miR-129-2两个重要成员，miR-129-3p起源于miR-129-2。近年来的研究发现，miR-129家族成员的表达失调与许多人类癌症的发生有关。例如，JIANG等[7]报道，miR-129-5p通过靶向下调白细胞介素-8并参与胃癌细胞的迁移和侵袭；CAO等[8]研究发现，miR-129-5p通过靶向促进膀胱癌细胞凋亡，并增加对吉西他滨的敏感性。此外，启动子甲基化抑制miR-129-2可诱导SOX4在肝癌中的过表达，并且miR-129-2的高甲基化与肿瘤肝内播散有关[9]；miR-129-5p还可靶向ETS1抑制肝癌细胞的转移[10]。LPAR3是内皮细胞分化基因受体家族的第三个成员，其通过与溶血磷脂酸特异性结合诱导细胞产生诸多生理病理反应。近年来的研究[11-13]发现，LPAR3可促进黑色素瘤细胞的存活，体内LPAR3的高表达可增加乳腺癌和口腔鳞癌的恶性程度，促进肿瘤的侵袭转移。肝癌细胞的迁移侵袭是影响肝癌治疗效果的重要因素，探讨肝癌细胞恶性增殖、迁移和侵袭的分子机制，寻找抑制肝癌细胞恶性行为的有效靶基因，对肝癌的研究和治疗具有重大意义。前人研究[3,5]发现，miR-129-3p在肝癌组织中表达下降，而LPAR3呈高表达，两者在肝癌的发生、发展中扮演重要角色，但miR-129-3p能否介导LPAR3表达参与调控肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭尚不清楚。

本研究首先对人正常肝细胞HL-7702和3种肝癌细胞SMMC-7721、HepG2和BEL-7402中miR-129-3p和LPAR3的表达情况进行检测，结果证实miR-129-3p在肝癌细胞中表达下调，LPAR3表达上调。随后以肝癌细胞SMMC-7721为研究对象，构建过表达miR-129-3p的SMMC-7721细胞株，发现过表达miR-129-3p可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。进一步研究表明，过表达miR-129-3p可抑制Cyclin D1和MMP-2蛋白的表达。此外，双荧光素酶报告基因实验和Western blotting检测显示，LPAR3是miR-129-3p的靶基因，miR-129-3p可负性调控LPAR3的表达。为进一步验证miR-129-3p是通过调控LPAR3表达进而影响肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，进行功能恢复实验，发现过表达LPAR3可逆转miR-129-3p对SMMC-7721细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。因此，我们推测miR-129-3p通过靶向下调LPAR3表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。PI3K/AKT途径是细胞内信号传导的重要通路，LI等[6]研究发现，miR-15b通过靶向LPAR3抑制PI3K/AKT通路，可抑制卵巢癌细胞的增殖，促进衰老和凋亡；此外，大量研究[14-17]证实，抑制PI3K/AKT通路活化可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。本研究发现，过表达miR-129-3p可抑制PI3K和AKT的表达，抑制PI3K/AKT通路激活，过表达LPAR3可逆转miR-129-3p对PI3K/AKT通路的抑制作用。提示miR-129-3p通过靶向LPAR3抑制PI3K/AKT通路的激活，进而抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，遏制肝癌的恶性发展。

综上所述，miR-129-3p通过靶向下调LPAR3表达抑制PI3K/AKT信号通路，进而抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，这为miR-129-3p作为肝癌临床治疗的分子靶点提供了新的理论依据。