鲤春病毒血症病毒研究进展

尚信池，尹玉伟，程 义，王 楠，刘 佳，张一琳，李月红

(吉林农业大学动物科学技术学院教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林 长春 130118)

鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)属于弹状病毒科[1]，其基因组由负义单链RNA组成，长度约为11 kb，并含有N，P，M，G，L五个基因。这5个基因分别编码核蛋白N、糖蛋白G、磷蛋白P、基质蛋白M和RNA聚合酶L。SVCV是几种经济上重要鲤科鱼类高致病性病原体，是世界动物卫生组织(OIE)必须申报的病原微生物，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。该病毒引起鲤春病毒血症病(SVC)主要在欧洲养殖的鲤鱼中流行，造成重大经济损失，病鱼临床症状主要表现为体内出血，神经紊乱，腹腔炎症和腹内积水。水温是影响该病暴发的重要因素，春季水温在11～17 ℃时受感染鱼类死亡率最高。目前尚没有开发出针对该病毒的有效疫苗和药物，控制该疾病的方法主要依赖于及时诊断和扑杀[2]。本文从SVCV的生物学特性、致病机制、检测、我国流行情况及防治，对目前SVCV研究的现阶段进展情况作一综述。

1 SVCV生物学特性

SVCV是鲤科鱼类重要的传染病，首次在欧洲发现，之后相继在亚洲和南美洲发现[3]。根据SVCV核苷酸序列差异，分为Ia、Ib、Ic和Id四个基因型，其中Ia和Id在南美洲和欧洲广泛流行。Ib和Ic在1980年被发现[4]。由于SVCV对鲤科鱼类的危害性，目前中国加强了对SVCV的检疫，同时发现中国的SVCV为亚洲的分支，然而近期在上海地区分离的SVCV相对于其他株表现出较低的致病性[5]。从2016年上海地区某发病草鱼身上分离出来的SVCV，通过进化树分析与2015年上海另一分离株有较为相似的分支，同时与亚洲株的特性不同。细胞感染试验结果显示，在25 ℃和28 ℃时病毒具有较强的感染性。体内试验证明，SVCV分离株能够引起试验动物典型临床症状，在16～20 ℃对草鱼和鲤鱼具有100%的致死率，对金鱼和锦鲤的致死率分别为100%和95%[5-6]。自2002年北卡罗来纳州的一个锦鲤养殖场首次暴发SVCV后，美国和加拿大至少有8次关于SVCV的不同报道，这种外来的病毒被认为对北美本土养殖鱼类具有潜在威胁，此项研究表明，宿主年龄是感染病毒和决定疾病结果的关键因素，其他因素，例如水温、病毒株、物种内在的易感性和饲养条件也可能影响感染动态[7]。

2 SVCV致病机制

近些年，研究越来越深入，Wang等(2017年)以斑马鱼为研究对象，通过控制稳定的水温，将SVCV感染斑马鱼，在感染后鱼体的脑和脾脏中检测到较高浓度的SVCV，此外他们在对脑和脾的转录组进行分析后发现，在脑中主要影响因素与甲型流感和单纯疱疹感染通路有关，脾中主要与结核病和弓形体病通路有关；同时转录组数据还显示，脾脏中的可变剪接情况增加，从而影响到病毒感染的过程[8-10]。Liu等(2013年)用双向电泳以及质谱分析仪研究SVCV对鲤鱼上皮细胞(EPC)的影响，感染SVCV前后EPC共有54个差异蛋白，主要集中在细胞骨架、大分子合成蛋白、应激压力蛋白和信号转导蛋白分支中[11]。Hu等(2018年)同样以斑马鱼为研究对象，对SVCV感染后机制做了深入研究，发现TBK1能够抑制IFN-1的释放从而促进病毒感染过程，其主要机制是，TBK1的不同亚基能够竞争性结合干扰素调节因子3(IFR3)并抑制IRF3的磷酸化，以此抑制IFN-1的释放，促进病毒的感染过程[12]。Zhao等(2018年)研究发现，在SVCV感染细胞(EPC细胞和胖头鲤细胞)后能够造成氧化损伤，其氧化损伤也是SVCV感染后重要的损伤机制，通过进一步研究发现，在SVCV感染后，线粒体的损伤是氧化损伤主要产生的部位，线粒体的损伤导致活性氧(ROS)的积累，造成细胞的损伤加剧，进一步促进病毒的感染[13]。Wang等(2017年)发现一个新的与泛素化有关的蛋白家族-TRIM，它在抗病毒活性中起到重要作用，研究中发现,克隆出的鲤鱼CDS区与斑马鱼的相似度为97%，与人和老鼠相似度为18%;组织分布分析显示，TRIM47在脑中具有最高的mRNA水平，一些免疫相关器官如肝和肾也具有相对高水平的TRIM47表达；体外和体内感染SVCV均显着降低TRIM47 mRNA水平，但其在蛋白质水平上不受病毒的影响；FHM细胞中的过表达TRIM47能够显著减少SVCV-G的mRNA水平，同时能够增加IFN-1的表达水平，从而减少了SVCV的积累，这样TRIM47在抗病毒中发挥重要作用[14]。Gong等(2019年)研究表明，线粒体抗病毒信号(MAVS)和IFN基因刺激物(MITA)的显性失活突变体MAVS-ΔTM与MITA-CT的过表达削弱了SVCV对鱼类IFN启动子的激活；MAVS-ΔTM和MITA-CT的阻断作用可能是通过调节SVCV介导的IRF3和双链RNA依赖的蛋白质激酶(PKR)的表达，因为MAVS-ΔTM表现出比MITA-CT更好的抑制作用；因此，鱼类MAVS和MITA都是SVCV触发的IFN表达所必需的[15]。Shao等(2016年)研究发现，活性氧(ROS)的产生和不能维持适当的氧化还原平衡会有助于病毒发病，核因子E2相关因子2(Nrf2)可以通过协调激活一系列细胞保护基因，来维持细胞内稳态和应对侵袭性。通过对Nrf2-ARE信号通路与SVCV复制之间的相互作用研究，发现SVCV感染可以诱导ROS以及蛋白质羰基和8-OHdG的积累；并伴随着Nrf2及其下游基因的上调，同时用D,L-萝卜硫素(SFN)和CDDO-Me激活Nrf2可以抑制SVCV的复制，siRNA抑制Nrf2可以促进SVCV的复制，所以Nrf2-ARE信号通路在SVCV感染后激活被动防御反应，靶向Nrf2途径具有对抗SVCV感染的潜力[16]。Wei等(2016年)研究发现，鲤鱼感染鲤春病毒后Toll样受体(TLRs)以及免疫相关基因表达升高，感染过程中模式识别受体TLR，干扰素和干扰素调节因子发挥重要的抗病毒作用；体内试验时，使用RT-PCR进行验证，在SVCV分别感染鲤鱼后的3、6、12 h，以及1、3、7、10 d进行采样，感染后3 h，发现SVCV的N蛋白、TLR2、TLR3、TLR7、TFN-1、ISG-15和Vig1显著增加；在5～10 h这段时间中，病毒的拷贝量逐渐减少，免疫应答相应地减弱，但仍存在较高的表达；在病毒感染后12 h，发现与免疫相关基因之间存在较高的相关性，所以延长免疫基因表达时间，是幸存的鱼主要应对SVCV的方式[17]。

3 SVCV检测

感染SVCV会导致鲤鱼大量死亡。及时诊断对于SVCV的预防和控制至关重要，并且成功检测出SVCV很大程度上取决于所使用的方法。Shao等(2016年)设计了2个TaqMan探针(N-tag1和N-tag2)，对应于2个扩增区域。使用SVCV 10/3，SVCV-265，SH140501，SH140502，SH140503和SH140522感染的EPC培养物进行测试，所有测试均证明2种探针都可以有效地扩增系统发育树上不同的SVCV分离株。从而建立了用于检测SVCV的N-靶向实时PCR策略[18]。安伟等选择SVCV的N蛋白保守序列，成功建立了SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，并且与常规RT-PCR进行比较，二者检验结果相同，均检出阳性样品，证明该方法可以运用到临床检验[19]。吴斌等通过“油包水”的形式将反应体系分割成小微滴，并对RT-PCR扩增反应的样品进行计数，建立了检测SVCV的数字 RT- PCR 检测方法，其优点能够对单个微滴中的目标基因进行检测，并且比实时定量RT-PCR的灵敏度更强[20]。刘遥等通过设计特异性的测序引物与指纹序列建立了SVCV的焦磷酸检测方法，该检测方法灵敏度高,最低检出核酸量为10 pg/μL。一般3～4 h就可以出结果，并且以具体序列为检测结果，防止了假阳性的出现，是国内外首次建立的SVCV焦磷酸检测技术[21]。

4 SVCV在我国流行情况

我国北京、河北、天津等地区均有鱼类感染SVCV的发生，2003年从天津养殖场分离得到了SVCV,这是我国第一次从无临床症状的观赏鱼体内分离获得的SVCV[22]。2007-2015年，王姝等从北京市9个区县采集673份样品，使用细胞分离法和聚合酶链式反应(PCR)进行检测，分离到28份SVCV阳性样品[23]。纪峰等研究结果表明，通过对黑龙江地区2015-2016年间不同地区的40个养殖场送检的鲤进行SVCV分离鉴定，得出SVCV检出率约为10%，并且来源于不同养殖场的病毒分离株的核酸序列呈现不同程度的差异，该结果进一步证明SVCV毒株在中国不同的鲤养殖环境中正在不断地进化[24]。目前中国没有关于SVCV大面积暴发的报道，但是上述的调查表明，该病毒在我国已有存在，并对我国鱼类的对外出口贸易造成极大负面影响。

5 防治措施

SVCV的防治对控制疫病的流行也起到了关键的作用，也为研究提供了新的思路。Embregts等(2018年)通过使用重组SVCV-G基因制备DNA疫苗和杆状病毒亚单位疫苗，进行免疫鲤鱼试验，发现不同的免疫方式对鲤鱼的保护率存在不同的差异，其中肌肉注射方式保护率较好[25]。Zhang等用载有编码全长基质蛋白新型功能化单壁碳纳米管(SWCNT) 作为DNA疫苗的递送载体，肌肉注射免疫后对幼年鲤鱼抗SVCV 具有显著的保护作用。此外，当选择功能化的SWCNT作为疫苗载体时，观察到良好的免疫保护作用(RPS大于51.3%)。因此，SVCV 的M基因编码基质蛋白可以用于SVCV DNA疫苗构建体，SWCNT可能作为针对鱼的病毒病原体的潜在高效DNA疫苗载体[26]。Medina-Gali等(2018年)研究发现，β-葡萄糖对感染SVCV斑马鱼有一定的治疗作用，其机制主要是调节炎性因子的释放过程，而体外试验发现，β-葡萄糖能够调节IL-1在细胞中的位置，以此抑制SVCV感染的过程[27]。Chen等(2018年)以Bavachin(BVN)作为补骨脂活性成分之一，发现其对SVCV具有强抗病毒活性，BVN对SVCV复制的抑制是在某种程度上阻断SVCV诱导的细胞凋亡，表明BVN可以抑制SVCV复制并阻断病毒释放以保护宿主细胞,从而达到治疗效果[28]。通过利用体外细胞分子水平筛选模型对化合物进行抗病毒活性评价,得到具有良好抗SVCV活性的香豆素，通过观察，感染SVCV 和药物处理后 EPC的形态学和各项生化指标的变化,以及使用多种细胞凋亡检测技术,对活性香豆素的抗SVCV活性作了进一步深入的研究，研究表明，香豆素C4、D5分别通过宿主抗病毒反应和直接作用病毒结构蛋白对SVCV增殖产生强烈的抑制作用,能够在体外和体内显著地降低病毒量,有效地维持宿主细胞生长活力,减少感染病毒斑马鱼的死亡率[29]。Shen等(2019年)研究发现，SVCV诱导的细胞形态学损伤和活性氧(ROS)生成都受到柴胡(Bupleurumyinchowense)的一个主要成分Saikosaponin D(SSD)处理的抑制，体内试验中SSD对感染SVCV斑马鱼和鲤鱼的治疗也有效；腹腔注射SSD[6 mg/(kg·bw)]可使斑马鱼的存活率提高36%，并抑制90%以上的SVCV 核蛋白和糖蛋白基因在肾脏和脾脏中表达，同时发现，SSD[6 mg/(kg·bw)]处理后鲤鱼的存活率也增加了32%；总之，SSD被证实是迄今为止具有最高抗SVCV活性的天然产物[30]。

6 展望

由于SVCV与狂犬病都属于弹状病毒科，现阶段对狂犬病的研究更加深入，我们可借鉴狂犬病的研究思路，进一步对SVCV进行研究，狂犬病抗病毒药物能够快速且有效地阻止正在进行复制的病毒分子，因此阻止病毒的进一步传播。还可以设想用于预防性使用的抗病毒药物，这些抗病毒药物能够预防外周神经细胞的感染，并且应该有可能取代目前用于抗病毒的免疫球蛋白[31-32]。Li等(2018年)通过噬斑克隆测定法从野生型弹状病毒株(MSRV-SS)中纯化筛选出MSRV-SS-7 菌株，并研究MSRV-SS-7克隆株抗弹状病毒作用，动物试验中分别使用腹膜腔注射和浸泡接种免疫中国鲈鱼，评估MSRV-SS-7株对毒性SCRV-GM的免疫保护作用，2种方法MSRV-SS-7对中国鲈鱼相对免疫保护率均为100%[33]，表明MSRV-SS-7是针对SCRV疾病的潜在活疫苗候选物，可以参考用来研究SVCV，使SVCV研究思路更加宽广。