缺氧条件下巨噬细胞移动抑制因子对肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

李嘉威，任 昊，李丽芳，张瑞强，王 涛，王文魁*

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学信息学院，山西太谷 030801）

肉鸡肺动脉高压综合征（Pulmonary Hypertension Syndrome，PHS）是一种以肺动脉高压、右心衰竭和体腔内积聚大量淡黄色液体为主要特征的代谢性疾病[1]。PHS 严重影响肉鸡养殖业发展，一直以来都受到国内外专家学者的高度重视，但迄今为止肉鸡PHS 的发病机理尚有待补充。目前趋于一致的看法是体内外诸多因素共同作用导致机体相对缺氧或绝对缺氧，缺氧刺激肺动脉血管内皮细胞及管壁平滑肌细胞异常增殖引起肺动脉重构，导致肺动脉平滑肌异常增殖、管腔狭窄、阻力增大，最终形成肺动脉高压[2]。

经由前期PHS 患病鸡组织采样研究发现，其肺组织中，巨噬细胞移动抑制因子（MIF）表达显著高于同群健康肉鸡[3]。MIF 在肺动脉高压形成过程中具有极其关键的作用。在低氧诱导小鼠PHS 模型中，肺组织MIF的mRNA 表达和血浆MIF 蛋白水平显著增加[4]；抑制MIF 可显著减弱肺血管重构、心脏肥大和右心室收缩压。

肺动脉重构是肉鸡PHS 的重要特征之一，而血管壁平滑肌细胞异常增殖是引发血管重构的主要原因之一[5]。肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的增殖受多种因素影响，如内皮素-1、5-羟色胺以及一氧化氮等生物活性因子的调节[6]。细胞周期蛋白D1（CyclinD1）可以加速细胞由G1 期向S 期过渡，与细胞增殖关系密切。CyclinD1 能够与细胞周期依赖性激酶（Cyclin-Dependent Kinases，CDK）中的CDK4 与CDK6 结 合并形成Cyclin-CDK[7]复合物，该复合物通过磷酸化成视网膜细胞蛋白（Retinoblastoma Protein，RB）使其无法与转录因子E2F 形成复合体，抑制E2F 活性，使E2F 发挥转录功能促进细胞增殖[8-10]。本试验选用肉鸡肺动脉平滑肌细胞，研究缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞MIF、CyclinD1 表达量变化和细胞增殖水平的变化，进一步研究缺氧条件下肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖是否符合“缺氧→MIF 分泌增加→促进CyclinD1 分泌→细胞增殖”这一猜想。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试剂 试验采用14～16 日龄AA 肉鸡鸡胚，购自山西康牧种鸡场。

主要试剂包括DMEM 高糖培养基（HyClone，SH30022.01）、新生牛血清（Gibco，16010-159）、P/S双抗青链霉素（Solarbio，P1400）、胶原酶Ⅱ（Solarbio，C8150）、氯化钴（Sigma，C8661）、RIPA 裂解液（Beyotime，P0013）、PMSF（Solarbio，P8340）、蛋白上样缓冲液（Solarbio，P1015）、凝胶配置试剂盒（Solarbio，AR0138）、蛋白预染marker（BBI，C610013）、ECL高敏发光试剂盒（Bioss，AR111）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，P0010）、MTT 细胞增殖检测试剂盒（Beyotime，C0009）、Anti-HIF-1α（BBI，D262108）、Anti-CyclinD1（Sigma，C7464）、Goat Anti-rabbit IgG（Bioss，BS-0295G），兔抗鸡MIF 多克隆抗体为实验室自制。

1.2 试验方法

1.2.1 肉鸡肺动脉平滑肌细胞分离培养 根据曾健滢酶消化法[11]适当改进，选用鸡胚替代成年肉鸡以避免生长环境、生活规律、饮食喜好等后天因素的干扰，采用胰蛋白酶与II 型胶原酶分步消化以提高位于肺动脉中层的平滑肌细胞纯度。取14～16 日龄鸡蛋，用75% 酒精对蛋壳进行消毒，转移到超净工作台上，无菌取出鸡胚。用眼科剪刀暴露胸腔，剥离Y 形肺动脉，置于预冷的PBS 缓冲液（无钙、镁）中清洗，除去残留的脂肪和结缔组织。用PBS 缓冲液（无钙、镁）漂洗3 次后置于无菌青霉素小瓶内并剪成直径约1 mm 大小的组织块，用浓度为0.25%的胰蛋白酶与0.1%的II 型胶原酶混合消化液37℃水浴静置5 min，以等体积37℃预热的完全培养基终止消化，弃上清后加入0.1% Ⅱ型胶原酶37℃水浴震荡消化40 min 后，再次加等体积37℃预热的完全培养液终止消化，移液枪吹打直至组织块呈絮状为止。经200 目筛网过滤，滤去未消化的组织团块，常温1 000 r/min 离心10 min 后弃上清，加入适量完全培养基使得细胞重新悬浮，以1×106个/mL 接种于6 孔培养板，37℃、5% CO2培养并于24 h、48 h 更换培养液。

1.2.2 建立肺动脉平滑肌细胞化学缺氧模型 第2 次换液后可获得符合造模条件的肉鸡肺动脉平滑肌细胞，换不含血清的DMEM 高糖培养基饥饿处理，等待24 h 后给予试验组不同浓度（400、600、800、1 000 μmol/L）CoCl2，正常组加入无血清培养基作对照，37℃、5%CO2培养24 h，摸索氯化钴法缺氧的最佳浓度。

1.2.3 MIF 阻断试验 给予缺氧模型不同浓度的MIF 阻断剂ISO-1（10、50、100、150、200 μmol/L），一组加入无血清的DMEM 高糖培养基做对照，37℃、5%CO2培养24 h。

1.2.4 蛋白免疫印迹检测 用RIPA 裂解经氯化钴处理的肺动脉平滑肌细胞各试验组与无血清培养基处理的对照 组，冰 浴20 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min 后取上清，测量蛋白浓度；加SDS 上样缓冲液，100℃变性8 min，跑SDS-PAGE 胶，转至NC 膜，5% 脱脂奶粉室温封闭90 min，4℃摇床孵育一抗过夜，TBST 洗膜10 min×3 次，室温摇床孵育二抗1 h，TBST 洗膜10 min×3 次，ECL 显色。

1.2.5 细胞增殖水平检测 在常氧对照组与缺氧模型组上均给予不同浓度的MIF 阻断剂ISO-1（0、10、50、100 μmol/L），37℃、5% CO2培养24 h 后使用细胞计数方法与MTT 试剂盒，以检测细胞增殖水平。

1.3 统计分析 蛋白免疫印迹检测后使用凝胶成像系统拍照，用Image J 软件计算蛋白条带灰度值，所得数据均以平均值± 标准差表示。MIF 表达量及细胞增殖数据用SPASS 19.0 软件进行方差分析和显著性检验。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 肉鸡肺动脉平滑肌细胞的镜下观察 分离消化初时的肺动脉平滑肌细胞呈类圆形且于培养液中悬浮；培养24 h 后细胞大部分贴壁，呈梭形及不规则形，有明显立体感且具有较强折光性（图1-A），48 h 后肺动脉平滑肌细胞状态良好（图1-B）。

2.2 肺动脉平滑肌细胞缺氧模型的构建 Western boltting检测结果显示（图2），与正常组相比，800 μmol/L CoCl2处理后HIF-1α表达量极显著提高。

2.3 ISO-1 阻断MIF 试验 Western blotting 检测结果显示（图3），与正常组相比，CoCl2组MIF 表达量极显著提高；与CoCl2处理组相比，MIF 阻断剂（ISO-1）处理后各组MIF 表达量均极显著降低。

2.4 阻断MIF 对CyclinD1 表达量的影响 Western blotting 检测结果显示（图4），与正常组相比，缺氧组CyclinD1 表达量显著提高；ISO-1（100 μmol/L）处理缺氧组后CyclinD1 表达量较单纯缺氧组极显著降低。

2.5 阻断MIF 对肺动脉平滑肌细胞增殖水平的影响MTT 法与细胞计数结果显示，单纯缺氧可显著促进PASMCs 增殖，ISO-1 处理后可明显降低PASMCs 增殖水平（图5）。

3 讨 论

为研究缺氧刺激对PASMCs 增殖的影响，首先需要分离和培养肉鸡原代PASMCs。体外培养PASMCs有助于更加直观地探讨缺氧对PASMCs 的影响，为肉鸡PHS 的病理变化研究提供试验依据。关于培养肉鸡原代PASMCs，文献多以10 日龄左右雏鸡为取材对象。本试验选鸡胚为取材对象主要基于以下考虑：鸡胚在蛋壳内处于密闭环境，与外界相对隔绝，不易受外界因素影响；同时也避免了雏鸡因个体生活习惯和饮食喜好等后天因素对试验结果造成的影响，使样本的均匀度更高，结果更可靠。

缺氧是肉鸡PHS 的重要诱因之一。现代集约化养殖条件下，肉鸡常常处于相对缺氧或绝对缺氧的生长环境，可引起其血液学变化和肺动脉重构，进而导致肺动脉高压并产生腹水。试验采用CoCl2化学缺氧模拟剂在上述体外培养肉鸡原代PASMCs 的基础上构建缺氧模型，由于HIF-1αODD 区域的脯氨酸在脯氨酸羟化酶（Proline Hydroxylase Inhibitors，PHD）作用下产生的脯氨酸残基能够与希佩尔林-道林蛋白（von Hippel-Lindau Protein,pvHL）底物识别元件结合后快速降解HIF-1α[12]，由于PHD 依赖于亚铁离子，故利用氧化还原性使钴离子竞争亚铁离子抑制PHD 活性，使HIF-1α无法与pvHL 结合，从而避免HIF-1α的降解[13]，在常氧条件下以HIF-1α为指标摸索CoCl2最佳浓度建立肉鸡PASMCs 缺氧模型。试验结果显示，使用浓度在500～1 000 μmol/L 的CoCl2处理肺动脉平滑肌细胞时，HIF-1α表达量显著增加，且在500～800 μmol/L 内HIF-1α表达量逐渐增大；超过一定浓度（1 000 μmol/L）时HIF-1α表达量反而降低，因此，选取800 μmol/L 处理肉鸡PASMCs，获得了肉鸡PASMCs 体外缺氧模型。

Welford 等[14]研究发现，小鼠MIF 启动子区域特异性低氧反应元件（HRE）可以与HIF-1α结合，以促进自身转录表达。本试验显示，使用浓度在500～1 000 μmol/L的CoCl2处理肺动脉平滑肌细胞时，MIF 表达量显著增加，且在500～800 μmol/L 内MIF 表达量逐渐增大；超过一定浓度（1 000 μmol/L）时MIF 表达量反而降低，结合之前HIF-1α表达变化，在500～1 000 μmol/L CoCl2时MIF 与HIF-1α变化趋势呈现高度拟合，提示肉鸡MIF 基因也存在相关低氧反应元件，通过缺氧促进HIF-1α表达可调控MIF 表达量增加。

CyclinD1 作为细胞增殖的“主开关”，是左右血管平滑肌细胞增殖的关键因素。其受多条上游信号通路的调控，其中丝裂原活化激酶（MAPK）信号通路占有很重要的地位且与细胞增殖的调控有着密切的关系[15-16]。试验前期PHS 患病肉鸡组织采样研究发现，其肺组织中MIF、CyclinD1 表达量均高于同群健康鸡[3]。Qin 等[17]研究发现，抑制MAPK-CyclinD1 通路可以抑制原代大鼠血管平滑肌细胞的增殖。Huang 等[18]研究发现，敲除小鼠肝癌细胞中MIF基因可抑制CyclinD1 的表达与肝癌细胞增殖。由此可以猜测，在原代肉鸡肺动脉平滑肌细胞中阻断MIF 分泌能抑制其CyclinD1 表达，进而抑制其增殖。为了验证这一猜想，试验首先采用不同浓度的MIF 抑制剂ISO-1（10、50、100、150、200 μmol/L）对MIF 进行阻断，筛选结果显示，与正常组相比，CoCl2模拟缺氧组MIF 表达量显著提高；与CoCl2模拟缺氧组相比，在使用不同浓度的ISO-1 后，各组MIF 表达量均显著降低，选用中间浓度（100 μmol/L）ISO-1 进行后续试验；结果与正常组相比，缺氧组CyclinD1 表达量显著提高；与单纯缺氧组相比，缺氧+ISO-1 处理组CyclinD1 表达量极显著降低。缺氧组PASMCs 的增殖对比常氧组显著提升，ISO-1 阻断MIF 后PASMCs 增殖对比缺氧组显著降低。

本试验摸索出肉鸡PASMCs 体外培养的最佳条件，在此基础上以HIF-1α为标志建立肺动脉平滑肌缺氧模型，利用此模型研究了MIF 与CyclinD1 的相关性，提示缺氧条件下肉鸡PASMCs 分泌MIF 增多，MIF 通过促进CyclinD1 的表达，引起PASMCs 的增殖。