大鼠颅脑损伤联合FK506诱导促进坐骨神经再生的研究

何新泽，田 冲，李 芹,杨 涛，林书卿,于立志，王成刚，孙金占，王 培

(1. 滨州市中心医院，山东 滨州 251700;2.承德医学院附属医院手足外科，河北 承德 067000)

颅脑损伤是现代社会飞速发展的副产物，同时合并周围神经损伤的患者临床工作中并不罕见。神经损伤后的病理生理变化复杂、神经损伤后的恢复受多种因素的影响，恢复不全，致残率较高[1]。何新泽等研究发现，实验大鼠在颅脑损伤后损伤的坐骨神经修复速度加快，但修复机制尚不清楚[2]；查阅大量研究文献发现应用FK506后损伤的周围神经修复明显优于对照组[3]。FK506促进神经修复的主要机制是通过免疫抑制作用、神经营养作用[4-10]。本实验拟通过借鉴FK506促进神经损伤恢复机制，对比实验结果，推测颅脑损伤促进神经损伤恢复可能的机制，指导进一步的深入研究。

1 材料和方法

1.1造模动物及材料：实验在2018年11月～2019年4月在滨州市中心医院完成。

实验动物：选用SPF级雄性SD大鼠160只，200～220 g[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK (京) 2012-0001]。饲养在昼夜各12 h节律下，实验室温度维持在(23±1)℃。将大鼠完全随机分为四组，每组40只。实验经过滨州市中心医院伦理委员会批准，按照国际动物实验标准执行。

主要设备及试剂：手术显微镜(LZL-6A型，镇江中天公司)，光学显微镜(BH-3型，Olympus公司)，电子分析天平(ESJ200-4 ±0.0001g)，FK506(Tacrolimus)100 mg(Selleck)，头孢唑啉纳(鲁抗制药，国药准字H19993050)、BL-420F系统(成都泰盟科技有限公司)、荧光金(Sigma)，冰冻切片机(Leica819)。

1.2造模步骤

1.2.1造模术前准备：禁食水4 h，术前30 min，肌内注射头孢唑啉钠10 mg/100 g预防感染，手术区域约2 cm2备皮剪毛。麻醉：10%水合氯醛按照0.35 ml/100 g进行腹腔全身麻醉；手术步骤：实验组(A1组、A2组)(颅脑损伤+坐骨神经损伤)：消毒，沿头部正中矢状切开，在颅骨冠状线后1.5 mm、中线偏左5 mm处开直径5 mm骨窗，撞击造成中度脑损伤；右侧臀部，显微镜下完全切断坐骨神经，9-0无损伤线缝合坐骨神经外膜4～6针[11-12]。对照组(B1组、B2组) (坐骨神经损伤)：SD大鼠仅于显微镜下完全切断右侧坐骨神经，缝合坐骨神经外膜。

1.2.2造模后的干预：分笼饲养在同样环境中。FK506用0.9% NaCl溶液稀释，1 ml 0.9% NaCl溶液+1 mg FK506，现用现配制，4℃恒温保存；造模手术12 h后，A1组SD大鼠给予FK506按1 mg/200 mg腹腔注射，A2组给予生理盐水按1 ml/200 mg腹腔注射，B1组大鼠给予FK506按1 mg/200 mg腹腔注射，B2组大鼠给予生理盐水按1 ml/200 mg腹腔注射。每天应用1次，连续2周。SD大鼠均存活。

1.3主要观察指标

1.3.1坐骨神经指数(sciatic nerve function index，SFI)的测量：分别于造模后4周、8周、12周，每组每次随机取10只大鼠。根据Schiaveto de Souza A的方法[8]，实验侧足3个参数分别为：实验侧足印长度(SPL)、实验侧足趾宽度(STS)、实验侧中间足趾距离(SIT)；正常侧足3个参数分别为正常侧足印长度(ZPL)、正常侧足趾宽度(ZTS)、正常侧中间足趾距离(ZIT)。

1.3.2动作电位幅值恢复率：分别于造模术后8周、12周，每组每次随机取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉后，暴露坐骨神经，取神经吻合口远端0.5 cm放置刺激电极1，近端放置刺激电极2，诱导电极、记录电极放在近神经根部，将记录到的电信号直接输入BL-420F系统中记录神经干的动作电位幅值恢复率，以评价神经再生情况。

1.3.3荧光金示踪：分别于造模术后12周，于坐骨神经断端以远0.5 cm处，注入4%的荧光金溶液5 μl，2 min后缓慢退针。术后7 d，深麻醉下开胸，左心室置入灌注针至升主动脉，剪开右心耳，灌流固定，取坐骨神经相应脊髓节段，冰冻切片机切片脊髓横断面20 μm。荧光显微镜下观察脊髓前角荧光金阳性运动神经元数目。

1.4统计学分析：采用SPSS19.0进行统计学分析，组间均数两两比较采用SNK-q检验；计数资料间接化法计算率，进行统计分析，以P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1造模后大鼠基本生活状态的观察：造模后所有动物均存活，未发现切口感染情况。造模手术后5 d B2组SD大鼠出现足部红肿明显，其他组红肿较轻。3周后，A2组、B1组、B2组SD大鼠足跟出现程度不同的溃疡面，A1组SD大鼠足部未见明显溃疡；12周时，各组SD大鼠足部溃疡基本痊愈，B2组SD大鼠出现足部的自食现象。

2.2大鼠坐骨神经功能指数(SFI)：暗箱测试结果显示，造模后第4周，A1组与A2组、B1组与B2组SD大鼠的坐骨神经功能指数接近，差异无统计学意义(P>0.05)，A1组SFI优于B1组、B2组，A2组SFI优于B1组、B2组，差异有统计学意义(P<0.01)；第4周后大鼠SFI逐渐降低，第8、12周时，A2组与B1组大鼠SFI接近，差异无统计学意义(P>0.05)，A1组SFI优于A2组、B1组、B2组大鼠，A2组SFI优于B2组，B1组SFI优于B2组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 脑损伤、FK506对周围神经损伤大鼠SFI的影响

2.3脑损伤、FK506对周围神经损伤大鼠神经干动作电位幅值恢复率的影响：实验在屏蔽橱内进行，室温保持在(25±0.5)℃之间，实验条件：刺激强度1.2 mV、波宽0.05 ms。动作电位幅值恢复率：将刺激电极1记录的动作电位幅值作分子，刺激电2记录的动作电位幅值作分母，将两者的比值转化为百分率。造模后第8周，各组大鼠坐骨神经干的动作电位幅值恢复率差异有统计学意义(P<0.01)，A1组优于A2组、B1组、B2组，A2组优于B1组、B2组，B1组优于B2组；第12周时，A2组与B1组大鼠坐骨神经干的动作电位幅值恢复率接近，差异无统计学意义(P>0.05)，A1组优于A2组、B1组、B2组，A2组优于B2组，B1组优于B2组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 脑损伤、FK506对周围神经损伤大鼠神经干动作电位幅值恢复率的影响

2.4荧光金示踪标记：光镜下，观察各组相应脊髓节段前角神经元细胞胞浆中荧光颗粒。每高倍视野下进行计数，统计分析结果；造模后第12周，各组脊髓神经元胞浆荧光金标记阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，A2组与B1组大鼠脊髓神经元胞浆HRP标记阳性率接近，差异无统计学意义(P>0.01)，A1组高于A2组、B1组、B2组，A2组高于B2组，B1组高于B2组，差异有统计学意义(P<0.01)。第12周时，A2组HRP标记脊髓前角阳性率(77.24±1.52)%与B1组大鼠脊髓神经元胞浆荧光金标记阳性率(78.60±2.23)%接近，差异无统计学意义(P>0.01)，A1组荧光金标记脊髓前角阳性率(82.37±1.33)%高于A2组(77.24±1.52)%、B1组(78.60±2.23)%、B2组(42.63±2.12)%，A2组荧光金标记脊髓前角阳性率高于B2组(42.63±2.12)%，B1组荧光金标记阳性率(78.60±2.23)%高于B2组(42.63±2.12)%，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

何新泽等动物实验发现大鼠脑损伤后损伤的坐骨神经的修复重建有明显促进作用，但具体修复机制尚不清楚[13-15]。本文通过动物实验比较颅脑损伤联合应用FK506的坐骨神经损伤大鼠损伤后的坐骨神经损伤恢复的情况。在所有的实验观测项目中，颅脑损伤联合FK506组(A1组)的坐骨神经修复效果要优于其他组(A2组、B1组、B2组)，这也证实了颅脑损伤可以与FK506协同促进坐骨神经损伤后的修复，推测脑损伤其诱导神经再生作用机制与FK506促进神经恢复机制可能不完全相同。

在Sunderland V型的外围神经损伤后，神经损伤切断了神经轴突内分泌的养分，不能将其输送到靶子器官上，靶子器官将失去活性和营养的支持，同时靶器官分泌的物质不能反馈给上一级中枢[16-18]。根据目前的FK506促进神经机制，促进外围神经修复相对明确是两个功能领域，发挥神经营养功能，形成一个FKBP12的综合体，加入功能地区后表达GAP-43，一个超蛋白质神经生长，并促进形成和扩大神经的生长由神经脉冲生成的生物电能，靶器官再生轴突的内径上升，厚厚的神经膜层作用范围增加[19-23]。这证实了FK506有助于恢复外围神经的营养功能，萎缩身体的部分看起来更容易溃疡，SFI、神经干动作电位恢复幅值率FK506组(A1组、A2组)恢复较好，提示促进损伤的修复作用，结合功能或复杂的FKBP12 区来促进表达GAP-43。

在周围神经损伤后，轴突的退化立即发生，轴突碎片是由巨噬细胞吞噬清除的，新的轴突、未退化的神经元延伸到由Schwann细胞组成的内膜神经的间隙，靶器官逐渐建立联系和营养[24-26]。FK506结合FKBP12，形成钙复合物抑制碱(CAN)，抑制T细胞的衰减，并抑制白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)的表达，以生产免疫抑制物被神经接收[27-28]。周围神经的损伤伴随着血液神经屏障的破坏，刺激纤维增生和巨噬细胞的扩散，形成影响神经修复的疤痕[29-30]。FK506可以抑制纤维素的扩散、迁移和生物活性，抑制纤维素的扩散，并通过免疫抑制作用促进神经损伤的重建和修复。神经内分泌系统的调节，创造微型环境的因素、Schwann细胞的信号有助于促进轴突再生[31]。神经交换的物质是轴浆的运输器官和再生轴芽器官通过内膜管再生作用于目标器官[29]。轴突内物质更好地恢复运输功能和靶器官的反馈是相互促进的[2]。脊髓前角荧光金标记证明A1组比 A2组、B1组、B2组的免疫神经内分泌系统在脑损伤期间的关系更加密切[32-33]，自主神经系统的中心结构被摧毁，导致免疫调节紊乱、改变或丧失，功能脑细胞的变性，导致Caspase瀑布反应性的激活，导致神经凋亡。

本试验结果提示，脑损伤伴随周围神经损伤动物早期应用FK506后，周围神经修复再生方面较好，脑损伤、FK506均可促进周围神经损伤的修复，并且协同促进神经损伤的修复效果更好，为脑损伤合并周围神经损伤的患者提供了新的治疗思路。但脑损伤促进周围神经损伤的具体机制仍需进一步深入研究。