清香风味导向的酿酒酵母Y2的分离鉴定及生物学特性研究

贾丽艳 田宇敏 荆 旭 韩 英 王 愈 杜小威

（1 山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷 030801

2 山西杏花村汾酒厂股份有限公司 山西汾阳 032209

3 山西白酒生物工程研究生教育创新中心 山西太谷 030801）

汾酒作为清香型白酒的代表，以其优良品质在国内外享有盛名[1]。汾酒生产仍沿用传统的生产方式，以高粱、豌豆、大麦为主料，谷糠、稻壳为辅料，通过开放式的操作方式网罗区域自然环境中的多种微生物，经固态发酵、蒸馏、勾兑而成[2-3]。经过长期自然驯化及汾酒独特的工艺条件，使得汾酒酒醅中形成了一个彼此共生、依次消长和代谢互补的特定微生物群落，包括霉菌、酵母菌、细菌等多种微生物。这些微生物及其代谢产物在酒醅的液化、糖化、酒化、酯化过程中发挥了重要作用，赋予了汾酒独特的风味物质[4-7]。汾酒酒醅是一个天然优质的微生物菌种资源库。酒醅菌种资源的开发利用，对于白酒的纯种发酵、强化发酵或定向发酵生产具有重要意义。

清香型白酒的主体香味成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯，占总酯的95%以上，其中乙酸乙酯占总酯的55%以上，具有清爽的果香味[8]。它的含量高低直接影响清香型白酒的质量和风格[9-11]。传统发酵白酒中酯香成分的含量波动较大，特别是夏季发酵生产时，由于环境温度高、湿度大，酒醅中乳酸菌含量高，易导致原料出酒率低，白酒中乳酸乙酯浓度相对偏高，而主体香乙酸乙酯含量相对较低，使酒体香味失去平衡，产生白酒生产上的“掉排”现象。为此，提高清香型白酒中乙酸乙酯含量，降低乳酸乙酯相对含量（“增乙降乳”），提高出酒率，预防白酒生产的“掉排”现象，成为夏季清香型白酒生产中亟需解决的问题。

本研究采用风味导向的方法，从汾酒酒醅中筛选高产乙酸乙酯的白酒酿造功能性菌株；基于形态学观察、生理生化特征及26S rDNA基因序列系统发育分析的微生物分类鉴定技术，鉴定菌株；通过对其生物学特性及在清香型白酒发酵过程中的应用效果，说明该菌株的应用前景，为清香型白酒的纯种发酵或强化发酵提供优质菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料和菌株

酒醅：发酵 7，15，23 d的酒醅。

白酒酿酒酵母Y0：山西农业大学生物工程实验室提供。

1.2 培养基

选择培养基：孟加拉红选择培养基，北京路桥公司。

YPD培养基：葡萄糖2 g，蛋白胨1 g，酵母提取物 1 g，蒸馏水 100mL，自然 pH值，121℃，0.1 MPa 灭菌20min[12]。

发酵液：将含糖量为67.88%的糖浆用蒸馏水稀释，使发酵液起始糖度为22°Bx，121℃蒸馏20 min，备用。

1.3 试验方法

1.3.1 酵母菌的分离 将酒醅混匀，称取10 g放入已灭菌的装有生理盐水90mL的三角瓶中，28℃恒温水浴培养30min，混匀，10倍倍比稀释至10-5。分别取100μL倍比稀释液涂布于孟加拉红选择培养基上，静置20min，待稀释液被吸收后，28℃倒置培养48 h，待菌落长出后，选择酵母菌菌落特征明显的单菌落，进一步划线2～3次，以获得纯菌落。将纯化的疑似酵母菌落转入YPD固体斜面，4℃保存，备用。

1.3.2 酵母的筛选 将分离筛选的菌株接种于YPD培养基培养24 h后，以3%的接种量分别接种于发酵液，28℃恒温培养7 d。采用气相色谱技术测定，并比对酵母发酵液中挥发性成分，筛选产清香香气成分的酵母。

1.3.3 酵母26S rDNA的PCR扩增及序列的测定和系统发育分析 酵母菌26S rDNA D1/D2区域序列扩增引物为NL1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′）和NL4（5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′），序列的测定由上海生工完成。待测菌株26S rDNA序列测序完成后，将得到的序列登陆http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank进行BLAST，选取数据库中有代表性的菌株26S rDNA，采用clustalx1.83软件的Multiple Sequence Alignment程序进行同源性序列比对；采用MEGA5.1软件，以邻接法（Neighbour-joining）构建系统发育树（Bootstrap=1000）[13]。

1.3.4 菌株耐受性研究

1.3.4.1 酒精耐受性试验 向含酒精分别为0%，6%，8%，10%，12%，14%的YPD液体培养基中接入3%新鲜发酵的酵母液，28℃培养，以未接种的YPD液体培养基做空白对照，每隔12 h，观察发酵液的混浊程度，有无白色沉淀产生，考察其酒精耐受性。

1.3.4.2 温度耐受性试验 向YPD液体培养基中接入3%新鲜发酵的酵母液，分别置于28，30，33，36，39，42，45℃下恒温培养，以未接种的YPD液体培养基做空白对照，每隔12 h，观察发酵液的混浊程度及有无白色沉淀的产生，考察其温度耐受性。

1.3.4.3 酸耐受性试验 用1 mol/L盐酸调节YPD 培养基pH值为1.5，2.0，2.5，3.0。接入3%新鲜发酵的酵母液，28℃恒温培养，以未接种的YPD液体培养基做空白对照，每隔12 h，观察发酵液的混浊程度及有无白色沉淀产生，考察其酸耐受性。

1.3.4.4 糖耐受性试验 向分别含葡萄糖15%，17%，18%，19%的YPD液体培养基中接入3%新鲜发酵的酵母液，28℃恒温培养，以未接种的YPD液体培养基做空白对照，每隔12 h观察发酵液的混浊程度及有无白色沉淀产生，考察其糖耐受性。

1.3.5 菌株在清香型固态白酒发酵过程中的应用 以清香型白酒大楂发酵并蒸馏后的糟醅为原料，添加1%的酵母菌株、10%清香型白酒生产用曲，厌氧发酵50 d，测定酒醅理化指标后蒸馏酒醅，获得白酒，测定白酒香气骨架成分。以清香型白酒正常发酵二楂酒为正常对照组。

2 结果与分析

2.1 菌株分离

根据酵母菌的菌落特征及菌体的镜检结果，从发酵7 d和15 d的酒醅中分离筛选出16株酵母，分别为Y1，Y2……Y16。

2.2 产清香味菌株筛选

通过嗅觉对比不同酵母发酵液挥发性物质的气味，发现酵母Y2发酵液比其它酵母发酵液产生的清香味浓郁。通过气相色谱检测发现，该酵母Y2可产生653mg/L乙酸乙酯，比其它酵母菌株产乙酸乙酯能力均高（图1），同时发现菌株Y2出酒率能达到10.5%（V/100 g），表明菌株Y2是一株兼具高产乙酸乙酯和酒精功能的菌株。

图1 不同酵母发酵液挥发性骨架成分Fig.1 The volatile component skeleton on fermentation liquid of different yeast

2.3 菌株的鉴定

2.3.1 菌落及菌体形态特征菌株Y2在YPD培养基上菌落为白色，表面光滑，中间厚，边缘薄，边缘与中央颜色一致，边缘整齐；菌体为椭圆形，单向出芽产生子细胞（图2）；产3枚光滑的卵圆形子囊孢子。

图2 菌株Y2的菌落及菌体特征Fig.2 Character on micrographic and colony of strain Y2

2.3.2 生理生化特性 表1为菌株Y2的碳源发酵和同化试验结果。由表1可知，菌株Y2可以发酵或同化利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、海藻糖和棉籽糖等，不能发酵或同化利用乳糖、L-阿拉伯糖、可溶性淀粉、纤维二糖、鼠李糖、柠檬酸、山梨醇和乙醇等。

表1 菌株Y2的碳源利用Table1 The usage on carbon source of strain Y2

2.3.3 26 S rDNA的Dl/D2序列分析 以菌株Y2的总DNA为模板，使用NL1和NL4一对引物扩增菌株Y2的26S rDNA近5’端的D1/D2序列并测序。将序列登陆 http：//www.genbank.com进行BLAST比对，结果显示菌株Y2与酿酒酵母具有很高的序列相似性，达到100%。以粟酒裂殖酵母（Saccharomyces mikatae）菌株为外群，通过多序列比对，以邻接法构建进化。结果表明，菌株Y2与酿酒酵母种中各菌株的遗传距离较近，而与酵母属中其它酵母的进化关系较远，如奇异酿酒酵母（Saccharomyces paradoxus）、库德里阿兹威酵母（Saccharomyces kudrisvzevii）。

综合菌株Y2的菌落、菌体特征、培养特征及系统发育分析结果，将其初步确定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

图3 依据26S rDNA基因序列构建的菌株Y2系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on the 26S rDNA sequence of strain Y2

2.4 菌株Y2的耐受性

2.4.1 酒精耐受性 乙醇是酿酒酵母菌发酵的重要产物，然而也是酵母菌细胞的抑制剂，菌株的乙醇耐受力与乙醇产率密切相关，可以将其作为筛选高产乙醇酵母的一个参考依据[14]。菌株Y2的酒精耐受性见表2，当酒精度在10%～12%之间时，培养12 h，发酵液变混浊并产生大量气泡，表明菌株Y2可快速生长，酒精度不影响菌株Y2的生长；当酒精度达到14%时，随着发酵时间的延长发酵液逐渐混浊，且有微量气泡产生，表明菌株Y2的生长受到抑制，生长缓慢；当酒精度达到16%时，培养48 h，发酵液仍保持清亮，表明菌株Y2生长受到酒精度的抑制。由上可知，菌株Y2的最高耐受酒精度为14%。

2.4.2 温度耐受性 温度直接影响酵母菌的生长繁殖和老化。温度较高时，可以促进酵母菌生长繁殖，加速其老化；如果温度太高，则会直接抑制酵母生长。不同酵母对温度的耐受性不同。菌株Y2的温度耐受性见表2，当温度在28～36℃时，培养12 h，发酵液变混浊并产生大量气泡，表明菌株Y2可快速生长，该温度适合菌株Y2生长；当温度达到39℃时，发酵液随发酵时间的延长逐渐混浊，且有微量气泡产生，表明菌株Y2生长受到影响，生长缓慢；当温度达到42℃时，培养48 h，发酵液仍保持清亮，表明菌株Y2生长受温度抑制。由上可知，菌株Y2的最高耐受温度为39℃。

2.4.3 酸耐受性 在酒醅的发酵过程中，随着发酵时间的延长，酒醅的pH值逐渐降低。若要继续发挥酵母的生理功能，必须具有一定的耐酸性。菌株Y2的pH耐受性结果见表2，当pH值为2.5～3.5时，培养12 h，发酵液变混浊并产生大量气泡，表明菌株Y2快速生长，该pH值范围适合菌体的生长；当pH值为2时，发酵液随发酵时间的延长逐渐混浊，且有微量气泡产生，表明菌株Y2生长受到影响，生长缓慢；当pH值达到1.5时，培养48 h，发酵液仍保持清亮，表明菌株Y2生长受pH值抑制。由上可知，菌株Y2的最高耐受的pH值为2。

2.4.4 糖耐受性菌株Y2的糖度耐受性结果见表2。当糖度为15%～19%时，培养12 h，发酵液变混浊，并产生大量气泡，表明菌株Y2生长快速，该糖度适合Y2的生长；当糖度达到18%时，发酵液逐渐混浊，且有微量气泡产生，表明菌株Y2生长受到影响，生长缓慢；当糖度达到19%时，培养48 h，发酵液保持清亮，表明菌株Y2生长受抑制。由上可知，菌株Y2的最高耐受糖度为18%。

表2 菌株Y2的环境耐受性Table2 The tolerance on strain Y2

2.5 菌株Y2在清香型白酒发酵过程中的应用

2.5.1 菌株Y2强化发酵对酒醅的影响菌株Y2强化发酵对酒醅的影响见图4，菌株Y2强化酒醅发酵提高了酒醅的酒精度，表明菌种强化发酵有利于提高酒醅的出酒率。此外酒醅中的残淀粉含量、还原糖含量较正常发酵对照组高，而酸度较低，这有利于酒醅蒸馏酒后丢糟的利用。此外，酒醅还具有扑鼻的果香味或乙酸乙酯味。

2.5.2 菌株Y2强化发酵对清香型白酒理化指标及主要风味物质的影响 香气物质种类及含量影响清香型白酒的风味，其中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量变化对白酒影响较大[15]。菌株Y2强化发酵对白酒理化指标及主要风味物质的影响结果，见表5。菌株Y2强化发酵组出酒率大于正常对照组；菌株强化发酵组乙酸乙酯含量为9.54 g/L，占到了总酯类含量的96.95%，与正常对照组相比，乙酸乙酯含量提高了2.5倍，总酯含量提高了64%，乙酸乙酯/乳酸乙酯比值提高至14.70，表明该酒为高乙酸乙酯、高乙酸乙酯/乳酸乙酯比的白酒，该酒适合用于勾调夏季乳酸乙酯偏高的基酒。此外，研究发现菌株Y2强化发酵酒总酸含量高，是对照组的1.62倍，可以作为清香型白酒高酸调味酒，以增加白酒的绵柔感。

图4 菌种Y2强化发酵对酒醅的影响Fig.4 The effect on strain Y2 to the Jiupei

表3 菌种Y2强化发酵蒸馏酒理化指标及主要风味物质Table3 The physical and chemical index and the main flavor substance of Baijiu fermented by strain Y2 and Daqu

2.5.3 菌株Y2强化发酵对清香型白酒感官品质的影响 国家级品酒师10人对菌种Y2强化发酵蒸馏白酒进行品评，一致认为菌株Y2强化发酵白酒具有清香、糟香、酯香，带酱感，落口酸爽、醇厚、绵柔，乙酸乙酯香突出的特点，适合用做清香型白酒的调味酒，以增加成品酒的酯香、糟香、酱香、醇厚绵柔感。

3 结论

通过嗅觉闻香和气相色谱分析，筛选得到一株出酒率高且产较高乙酸乙酯的菌株Y2，该菌株在糖浆发酵液中28℃培养7 d，可产乙酸乙酯653 mg/L，发酵液酒精度可达10.5%。经菌落形态观察及分子生物学方法鉴定，确定该菌株为酿酒酵母。该酵母具有良好的环境耐受性，最高耐受温度为39℃；耐酸性好，在pH 2.0的条件下能够生长；耐酒精能力强，最高耐受酒精度为14%（V/V）；耐糖性好，可耐受葡萄糖含量为18%。

菌株Y2可用于发酵清香型白酒，生产的白酒具有清香、糟香、酯香，带酱感，落口酸爽、醇厚、绵柔，乙酸乙酯香突出的特点，可作为清香型白酒的调香酒。